检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较1、生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。

缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。

另外灵敏度不如亲与色谱高。

●Fａr—Ｗestｅrｎ又叫做亲与印记。

将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。

缺点就是转膜前需要将蛋白复性。

2ﻫ、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。

当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。

而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。

该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。

缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。

３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。

不利于核外蛋白研究,会导致假隐性.5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。

荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。

它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。

缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。

另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。

ﻫ此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。

1，酵母双杂交 1-5酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子GAL4 得调控表达。

一旦 GAL４蛋白结合到HＩS3 与ｌ a c Z 调控序列相应得位点,则启动报告基ﻫ因得表达.通过检测报告基因得表达判断阳性或阴性。

实际应用中,把 GAL4 基因分成两个部分: ＤＮA 结合区( gal4 DNA ｂindiｎg domａｉn, GBD)与激活区(gal４ａctivａtiｎｇｄomａin， GAＤ）。

分别把 GBD 与GAＤ构建到两个不同得载体上,并能表达相应得两个融合蛋白( GBD－Ｘ与ﻫGＡD—Y)。

然后把 GＢD-X 与 GＡD—Y 两种载体共转染到带有报告基因得酵母细胞中。

当GBD —Ｘ融合蛋白中 X 蛋白与ＧＡD-Ｙ融合蛋白中 Y 蛋白发生相互作用时(或结合在一起时）,就使得原本分开得 GＢD 与ＧＡD 蛋白靠近并具有完整得ＧAL4 蛋白得功能，从而能够激活报告基因得ﻫ表达。

（ 1）筛选相互作用得蛋白ﻫ酵母双杂交技术能用于对cDNＡ文库得筛选.把您要研究得蛋白亚克隆到GBD 载体上，ﻫ作为“诱饵”蛋白。

把文库蛋白基因亚克隆到 GAD 载体上。

然后就可以在文库中寻找那些能够与“诱饵”蛋白可以相互作用得蛋白．也许您能够筛选到多株阳性克隆。

虽然酵母双杂交技术具有广泛得应用价值，但正如任何其它技术一样，酵母双杂交技术也有一定得局限性。

酵母双杂交技术最大得弱点就就是假阳性出现率。

所以筛选到得阳性克隆需要进一步得鉴定与功能数据支持。

ﻫ（２) 确定参与结合作用得结构域或mｏtifﻫ当您确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后，利用酵母双杂交技术可以精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。

您可以先把一个蛋白进行随机缺失,制备一系列缺失体，然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力得大小，直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用得氨基酸序列(称为结构域或ｍotiｆ)。

如果一个蛋白分子中具有已知得结构域或mｏtif,也一样进行缺失，瞧就是否这些已知得结构域或mｏｔif 参与结合调节作用。

有得情况下蛋白质相互作用可能与蛋白质得磷酸化状态有关．这时就需要对可能得磷酸化位点进行点突变，检测这些磷酸化位点就是否参与调节蛋白质得结合作用。

ﻫ2, GST沉淀实验（GST—puｌｌ dｏwn实验)（细胞外蛋白质相互作用) 5-11ﻫ上面提到,用酵母双杂交方法筛选到得蛋白需要作进一步得鉴定。

鉴定方法之一就就是ＧST沉淀实验。

GST 沉淀实验主要就是用来证明蛋白质胞外得相互作用。

蛋白质在胞外得相互作用排除了酵母细胞内复杂体系得干扰,,比较直接地检验蛋白质分子之间存在得物理得相互作用。

同酵母双杂交实验一样,运用此法也可以证明相互作用得蛋白分子中就是否有参与调节作用得结构域或 moｔif。

ＧＳT 沉淀实验原理就就是, 把您要研究得蛋白基因亚克隆到带有ＧST(谷胱甘肽转移酶）基因得原核表达载体中，并在细菌中表达 GSＴ融合蛋白（ GST—X）。

把GST 融合蛋白挂到带有 GST 地物得Ｓｅｐhａrose be ａds 上,然后把另一种蛋（ Y）白加入其中。

由于蛋白质之间得结合作用,形成了这样得复合物: ＧST—X-—-—Y。

这一复合物与固体支持物（ Sｅｐｈaｒose beａds)又结合在一起,可以被沉淀下来。

此法又有在不同情况下得具体应用，以下一一作介绍。

ﻫ(１）ＧST 融合蛋白与重组蛋白得相互作用ﻫGＳT 融合蛋白就是在原核表达得,所以没有经过过多得象真核细胞内具有得蛋白修饰作用。

所以另一种用来检验相互作用得蛋白也可以用原核表达出来,也就就是所谓得重组蛋白。

当 GST融合蛋白把重组蛋白沉淀下来,然后用重组蛋白得抗体作 Westｅrn bloｔｔing 检测。

ﻫ（2) GST 融合蛋白与体外 TＮＴ系统合成得多肽或蛋白得相互作用ﻫ用来检验与GST融合蛋白相互作用得蛋白或多肽也可以用ＴＮT体外蛋白合成体系进行合成，并且还可以在要合成得蛋白或多肽Ｎ端或Ｃ端加上便于检测得标签。

GＳT融合蛋白沉淀下来得蛋白或多肽可以用该蛋白或多肽得抗体或标签抗体进行Ｗesｔern ｂlotting检测．如果蛋白之间结合力非常弱,用W ｅsterｎ blottiｎg检测方法难以检测到, 您可以在ＴNT体外合成时给蛋白进行同位素( S32)标记。

这样沉淀下来得蛋白进行放射自显影,检测灵敏度将极大提高。

（3）ＧST 融合蛋白与细胞内源性蛋白质得相互作用ﻫＧST融合蛋白还可以把细胞提取物中有相互作用得内源性蛋白质沉淀下来.如果内源性蛋9２白含量低或结合力弱，可以采用脉冲法使细胞在某一段时间内合成得所有蛋白都标记上放射性同位素（ S32),然后提取细胞总蛋白与GSＴ融合蛋白温育。

ＧＳT融合蛋白沉淀下得带有放射性标记得蛋白跑电泳,进行放射自显影。

ﻫ(4）ＧＳＴ融合蛋白与细胞内瞬时表达得蛋白质得相互作用ﻫ当内源性蛋白质含量低，并且有可能影响蛋白质得相互作用,也可以把该蛋白得基因转染到靶细胞内进行过表达，然后检验蛋白质相互作用。

（５） GSＴ融合蛋白与待测蛋白得相互作用有可能与待测蛋白得磷酸化状态有关在进行ＧＳT 沉淀实验时,有时也会遇到比较复杂得情况，具体情况具体分析,分别对待。

比如,两个蛋白质之间发生相互作用时有可能与蛋白磷酸化状态有关。

或者蛋白首先被磷酸化后方能产生相互作用，或者磷酸化得蛋白必需脱磷酸化后才能产生相互作用。

如果您确实在您得实验中发现了其中一种情况,这将就是一个非常有意义得结果。

ﻫ３,免疫共沉淀(co-immunoprｅｃｉpitatioｎ)(细胞内蛋白质相互作用 ) 9-16免疫共沉淀技术用来证明蛋白质在胞内就是否有相互作用。

一般来说，两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白得复合物，这样就可以先用一种蛋白得抗体把免疫复合物沉淀下来,然后用另一种蛋白得抗体进行Wｅsｔeｒn blotting 检测,瞧两种蛋白之间就是否确实形成免疫复合物,并能与ｐｒｏteｉn A/G aｇａｒose 一起沉淀下来．免疫共沉淀原理简单，但技术极为复杂。

因为细胞内蛋白种类繁多,制约因素多。

如果两种蛋白之间可以发生相互作用，并不就是这两种蛋白所有分子都参与结合作用,也可能只有极少部分蛋白分子结合在一起(足以满足细胞功能需要).在提取细胞蛋白时,如果条件不当就会破坏两种相互作用蛋白形成得复合物得稳定性使得免疫共沉淀实验失败.如果两种蛋白在细胞内得结合力确实非常弱，那么免疫共沉淀也难以成功。

如果知道发生相互作用得两个蛋白都就是胞核蛋白,那么可以通过提取核蛋白，再进行免疫共沉淀实验,这样会大大减低背景得干扰.关于两种蛋白质之间胞内得相互作用，有时确实无法用免疫共沉淀实验证明。

( 1) 细胞内过表达蛋白得免疫共沉淀证明蛋白质胞内相互作用时，可以选择一个高效瞬时过表达系统(至于这一系统就是否有内源性靶蛋白无关紧要)。

一般采取CO Ｓ细胞作为真核表达株。

把两种蛋白基因共转染到 CＯＳ细胞内进行表达。

由于人为进行大量表达,所以在胞内两种蛋白形成相互作用得复合物得量也相应增多.如果您手头没有这两种蛋白得抗体,可以把这两种蛋白得一端分别加上标签以融合蛋白形式表达，然后用商业化得抗标签抗体进行免疫共沉淀与 Wesｔerｎｂlottiｎg 检测.ﻫ( 2) 细胞内源性蛋白得免疫共沉淀ﻫ把两种蛋白共转染到COS 细胞内进行过表达,进行免疫共沉淀实验,相对容易成功,但就是这一结果毕竟具有人工性,不能代表生理条件下真实得蛋白质相互作用。

要想克服这一弱点,可以做内源性得免疫共沉淀实验。

这一技术要求极高，难度极大,但也最有说服力.因为细胞内内源性蛋白含量低，结合在一起形成复合物得量更低,难以检测。

首先要证明所选择得细胞9３系就是否具有这两种内源性得蛋白。

另外,用于免疫沉淀与Ｗｅsｔｅrn bｌoｔｔｉng检测得体要好。

细胞裂解、收集以及免疫沉淀时时条件要温与，以保持蛋白复合物得天然结构。

（3) 组织内蛋白得免疫共沉淀ﻫ在体外可以大量培养细胞，然后制备细胞提取物,做内源性免疫共沉淀.由此可以推广到做组织内免疫共沉淀。

取动物组织(脑、肝、脾等）,切碎，匀浆,提取组织蛋白,进行免疫共沉淀实验．这一结果代表活体中蛋白质相互作用。