微生物学基础技术---培养基、包扎、灭菌一、学习目的•了解微生物学实验课程和教学方法；•学习培养皿包扎等常规微生物学基础技术；•学会高压蒸汽灭菌锅的使用；观看在线视频,学习并实践以下技术：•学习培养基的制备，全班分组制备本学期所需的各种培养基；•微生物的接种和培养技术;•培养基及其他材料的灭菌，无菌倒平板的技术；第I部分培养基的制作实验目的•学习药品的称量方法，•掌握培养基的配置方法，•学会高压蒸汽灭菌锅的使用；•配制本学期实验课程需要的培养基。

实验试剂与器材▪试剂：乳糖，牛肉膏，酵母粉，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，琼脂粉，1mol/L NaOH，1mol/L HCl；▪器材：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH 5.5-9.0),棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。

实验原理▪培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

培养基种类繁多。

但无论如何，一般均应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐以及生长因素等。

▪基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨、和NaCl。

其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。

培养基培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基。

液体培养基斜面培养基平板培养基固体培养基微生物的培养固体平板培养固体斜面培养液体振荡培养液体静置培养各种培养基配方（1L）1.细菌LB：Tryptone(胰蛋白胨)：10g, Yeast Extract(酵母提取物)：5g,NaCl(氯化钠)：10g，琼脂粉15克；pH 7.2，121℃灭菌20 min。

2.放线菌高氏1号：可溶性淀粉20g（先用少量冷水把可溶性淀粉调成糊状，用文火加热，再加入水和其他药品）；NaCI0.5g；KNO31g ；K2HPO4.3H2O 0.5g；MgSO4.7H2O 0.5g ；FeSO4.7H2O 0.01g; 琼脂粉15克,pH 7.4～7.6，121℃灭菌20 min。

各种培养基配方（1L）3.霉菌PDA：马铃薯200g，去皮，切小块，用电磁炉煮30min，用4层纱布过滤，取滤液定容，再加蔗糖20g，琼脂粉18克，121℃灭菌20min；4.酵母YPD：酵母粉10g，蛋白胨20g，无水葡萄糖20g，琼脂粉18g，115℃灭菌20min；培养皿的包扎•培养皿通常用旧报纸包紧。

一般取10套培养皿作一包。

注意培养皿的取向应一致。

包装时，一边卷滚，一边将两头的报纸往内覆折。

•收尾时将露出来的纸头一并折入里面。

最后，将包好的培养皿放在手上轻轻1、天平的调节调节天平底部两侧手轮至水平仪气泡处于中心*称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。

称取完毕，立即盖好瓶盖，不要盖错（注意内盖）。

按培养基配方比例依次准确地称取各种药品放入烧杯中。

2、称量3、溶化水量，用玻棒或磁力棒搅拌溶解。

也可以在电炉、微波炉上加热使其溶解。

待药品完全溶解后，补充水定容。

4、调pH在未调pH前,先测量培养基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH,直至pH达本实验所需；反之,用1mol/L HCl进行调节。

琼脂的使用琼脂的特点：▪凝点和熔点之间的温度相差很大。

在水中需加热至95℃时才开始熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。

琼脂的浓度，通常是液体培养基的1～2%之间。

固体培养基配制中琼脂的使用：▪方法1：琼脂可以与其他药品同时称量，但需要加热煮沸才能熔化，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。

同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。

▪方法2：琼脂也可以待其他药品溶化好，调节pH后，再按照分装的量称入锥形瓶中，注意灭菌前一定充分摇匀；注意：斜面不可以用这样方法配制！•试管的分装：利用分装器将配制好的培养基分装入试管内。

以其高度的1/4左右为宜。

•锥形瓶的分装：以量筒或烧杯向锥形瓶分装培养基，以其高度的1/4--1/3左右为宜。

分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)分装器口上，以免沾污塞子而引起污染。

（分装完毕后马上清洗）•培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上硅胶塞(双层铝箔纸、8层纱布、棉塞等，后两种外面需要报防潮纸)，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。

•在瓶外写好培养基名称和制作日期。

6、加塞和标记、灭菌7将上述培养基进行高压蒸气灭菌第II部分高温高压湿热灭菌121℃高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能逸出，而增加了锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

高压蒸汽灭菌原理实验设备手提式半自动灭菌器1.下手柄;2.上手柄（内有安全锁）;3.排汽孔;4.放汽阀;5.压力表;6.安全阀;7.桶身;8.底座;9.电源开关;10.放水阀;11.调温旋钮;12.加热灯;13.保温灯;14.时间旋钮7121381494321561011DSX-280B （自动）内部构造手提式灭菌锅结构1、首先将内层锅取出，再用纯水将外层锅的水面补齐到与三角搁架相平。

灭菌步骤（两人一组）注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

3、加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。

顺时针旋转拧紧。

红箭头朝右。

12374、打开电源开关，调节温度和保温时间，同时打开排气阀。

5、待水沸腾将冷空气完全排尽后（大量冒气七分钟），关上排气阀。

让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。

当锅内的压力上升到所需压力时，维持压力至所需时间。

常规灭菌条件：121℃条件下灭菌20min。

6、灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，将盖子打开一缝，利用锅内的余热烘干灭菌物品，取出灭菌物品。

17、验菌培养灭菌结束后，培养皿等物品放入烘箱烘干；取出试管培养基摆制斜面，待凝固后，让入37℃温箱内培养48小时，无菌生长则可以使用，否则重做。

待灭菌后的试管培养基冷至60℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

7、搁置斜面过滤除菌▪过滤除菌法（filtration）是用物理阻留的方法将液体或空气的细菌除去，以达到无菌目的。

所用的器具是含有微小孔径的滤菌器（filter）。

主要用于血清、毒素、抗生素等不耐热生物制品及空气的除菌。

常用的滤菌器有薄膜滤菌器（0.45μm和0.22μm孔径）。

第III部分干热灭菌、无菌平板的制作实验目的•学习干热灭菌技术；•学习无菌操作技术。

•学习无菌平板制备技术。

干热灭菌原理干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。

一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。

火焰灭菌法是指用火焰直接烧灼的灭菌方法。

该方法灭菌迅速、可靠、简便，适合于耐火焰材料（如金属、玻璃及瓷器等）物品与用具的灭菌，不适合药品的灭菌。

干热空气灭菌法•是指用高温干热空气灭菌的方法。

该法适用于耐高温的玻璃和金属制品，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。

•在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。

因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。

为了保证灭菌效果，一般规定：135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；180-200ºC灭菌1-2h。

高温干热灭菌箱干热灭菌培养皿用不锈钢箱装熔化培养基1.将三角瓶中已灭菌的培养基置于电炉上或微波炉中加热使其熔化，加热时必须不时摇动三角瓶，以免受热不均而引起爆裂。

待培养基完全熔化后，置一旁冷却至55-60 ℃。

超净工作台紫外灭菌30 min ，酒精棉球擦手和超净台。

当培养基冷却至60 ℃左右时，在火焰旁打开灭菌培养皿的包装，准备倒平板。

2.超净台准备▪揭下瓶塞，右手持三角瓶于火焰旁边，瓶口要保持对着火焰，左手拿将皿盖打开，迅速倒入培养基，以液体刚好盖满平皿底部为宜（25ml 左右的培养基制成的9cm 平板厚度约4mm ），合上皿盖后，置于水平桌面上略加转动，等待其凝固。

3.手持法倒平板皿成摞放置，左手拿将皿盖打开，右手持三角瓶倒入培养基；在无菌培养皿底部注明培养基名称（小字靠边）。

皿加法4.皿加法倒平板制好的平板5. 验菌培养培养基凝固后，倒置于37℃温箱内培养过夜，第二天取出，无菌生长则可以使用，否则重做。

第III部分微生物的接种和无菌培养实验目的•学习无菌操作技术。

•学习微生物划线培养技术。

实验原理自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。

人们要研究各种微生物的特性，首先需使该微生物处于纯培养状态。

也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一种或株，他们有着共同的来源，是同一细胞的后代。

▪为了获得单菌落，实验室常用的方法是平板划线分离法。

平板划线分离法可分为连续划线和分区划线，但两种方法的主导思想都是将样品由浓变稀，从多组分的混合样品最后得到较纯的单菌落。

▪将平板划线分离得到的单菌落接种到斜面上，可进一步观察其生长特征。

微生物在斜面培养基上生长，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、舒展状、树枝状、或假根状。

培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。

平板划线分离连续划线分区划线酒精灯接种棒（接种环）接种工具及灭菌方法酒精灯火焰外焰灼烧接种棒金属部分（接种棒其他部分用酒精棉擦过）灭菌并冷却的接种环蘸取少量微生物接种到新鲜培养基1、灼烧接种棒灭菌，在酒精中冷却无菌操作。