思考题：
对检验检疫技术的要求有哪些？ 检验检疫取样时有哪些依据？ 简要说明植物病原真菌检疫的主要方法。 列举出检测检疫性病原细菌的检测方法。
植物线虫检验检疫中应注意哪些问题？
第一节 植物病原真菌的检疫检疫技术
• 病原真菌的属、种主要依据其形态特征鉴定，有 时形态相似的近似种类需接种寄主，测定其致病 性。鉴定病原真菌专化型和小种，也需接种鉴别 寄主。
• 除洗涤检验法的检验结果用单位重量种子的孢子 负载量表示外，其它检验方法都能获得带菌百分 率或发病百分率。
一、直接检验
的检查、可用于病害普查，口岸检 疫和产地检疫等。
间接法
一抗
底物
二抗
免疫荧光技术
分子检测技术
特异性基因或DNA序列用于检测病原菌
核糖体DNA基础的PCR策略
分子检测试剂盒
生物学检测技术
• 鉴别寄主检测--以鉴别寄主反应或指示植物为依 据的方法。
• 曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境 和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少。
ELISA)是把抗原、抗
体的免疫反应和酶的 高效催化反应有机结 合而发展起来的一种 综合技术。
血清学检测技术
• ELISA的测定方法:直接法、间接 法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法、 双抗体夹心法等6种。 • ELISA的特征:灵敏度高，特异性 强，安全、快速并易观察。它可进
行定性定量测定，适于大批量样品
• 程序： • 根据习性进行分离 • 杀死和固定 • 制作玻片 • 显微测量线虫的主要特征 • 种内鉴定――查阅文献， 结合主要特征鉴定。
A 幼虫B.幼虫头部C.幼虫 侧区D.二龄幼虫体前部E. 雄虫体前部F.雄虫尾部
注意事项
• 正确判别玻片种线虫的体位――前提 • 群体的概念――同一种线虫，因寄主、营 养及环境条件的变化，种内虫体间有一定 的变异范围。因此，要仔细观察，测量较 多的数量，防治把种内变异鉴定位不同的 种。 • 了解各类线虫的生活史，正确区分幼虫和 成虫――成虫 的形态特征是鉴定的重要依 据。
• 离心管内容已形成一层极难沉降的孢子薄膜。管 壁也可能黏附孢子; • 视野内孢子分布不均匀; • 操作不规范，不严格 。
保湿萌芽检验法
七、分离培养检验
• 主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他之物产 品内部，不易发现和鉴定的病原菌； • 当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无 特殊的病原菌可供鉴定的场合。
植物寄生线虫的各种分离方法
直接解剖法-- 内 生线虫在体视显
微镜下用解剖针
直接解剖病组织
•
简易贝尔曼漏斗法:分离少量植物材料中有活 动能力的线虫。
清洗材料 收集线虫 切成小段
裹纱布
浸入漏斗12h
• 浅盘法
•
卡勃过筛分离法――本法用于从大量土壤中分离
各类线虫。
检疫性线虫的一般检验程序及注意事项
第四章 检疫性有害生物（病原菌） 检验检测技术
•病原真菌 •病原细菌
•病原病毒
•病原线虫
• 目的：发现、检出和鉴定有害
生物，作为出证或检疫处理的
依据
• 方式：现场检查、实验室检验
对检疫检验技术的要求
①准确可靠，灵敏高度，能检出低量有害生物；
②快速、简单、方便易行； ③有标准化的操作规程，检验结果重复性好 ④安全，不扩散有害生物。
• 植物病原线虫是躯体很小， 而内部又有各种较复杂器 官的低等动物，再加上其
一些特殊的分布和生物学
习性等，检测方法有所不
同。
罹病样品的采集及保存方法
罹病植物――采集有明显症状的地上或地下部分 土壤样本――20－30cm耕作层的土壤，定点或棋 盘式多点采样。 保存方法――所有材料均应装入塑料袋中保湿， 及时分离或4度低温保存。
电了显微镜观察
• 目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊 断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。
免疫学检测法
快速免疫滤纸测定法(Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA)
免疫胶体金技术 (Immune colloidal gold technique)
分子生物学检测方法
取样方法的依据
• 有害生物的分布规律
• 货物的数量 • 装载方式等因素确定
样品数量（容量）大小依据
• 有害生物的带有率;
• 检验方法的灵敏度; • 检验所要求的精度;
• 货物种类与特点;
• 检验所允许的时间和花费等许多因素确定。
• 有害生物的带有率越低，检验方法的灵敏度越低， 检验精度要求越高，所需样品数量就越多。
切片置于1.5％水琼脂平板上， 在28℃和黑暗条件下培养3d
如确系该菌，则接种部 位软腐、维管束褐变
生理生化及快速测定法
• • 生化测定试剂盒： Biolog 测定：
噬菌体检测血清学检测技术来自酶联免疫吸附技术(ELISA)-- 酶联免疫吸
附测定(Enzyme linked immunology assay,
二、过筛检验
• 检验粮谷、种子、油料、干果和生药材，检验病 粒，菌婴、菌核、病残体等
• 种子过筛后可检出夹杂的菌瘿、菌核、病株残屑 和土壤，都需仔细鉴别。 • 小麦矮腥黑穗病的菌婴
三、比重检验法
• 原理：菌婴、菌核和病秕籽粒 都要比健康的籽粒轻。
• 用于种子、粮谷、豆类中的菌
婴、菌核和病秕籽粒。
多聚酶链式反应(PCR)
分子信标(Molecular beacon)
杂交诱捕PCR-ELISA原理
实时荧光PCR原理
核酸斑点杂交技术
分子生物学和免疫学相结合检测方法
• 免疫捕获反转录PCR（Immunocapture reverse transcript PCR, IC-RT-PCR）
第四节 植物病原线虫的检疫检验技术
进一步诊断
• 分离培养：选择新鲜的病斑或病键组织交界 处――表面消毒――清水洗净――碾碎稀释 ――划线培养――观察
•
•
致病性测定：目的是区分致病性细菌和腐生菌。
过敏性反应(Hypersensitive reaction, HR)是指病 原细菌在非寄主植物上引起枯斑反应的现象，腐 生性细菌则不表现典型的枯斑。
接种方法
• 按照柯赫氏法则，从发病植物上得到的分离物，
在健康的寄主植物上接种发病并与先前症状一致， 然后再次从发病部位分离到与先前相同的分离物， 才能证明该分离物是引致这种病害的病原物。常 用的接种方法有喷雾、注射、针刺和浸泡等。
• 操作：细菌溢脓或分离纯化细菌――自然 或人工接种――观察
针刺接种法接种甘蓝叶片中肋
第二节 病原细菌的检疫检验技术
• 植物细菌病害有软腐、环腐、萎蔫、溃疡、疮痂、 枝枯、叶斑、组织增生（瘿瘤、发根）等多种症 状。叶片上病斑常呈水渍状，上有细菌溢脓。病 部切片镜检可见细菌溢。
• 田间诊断――了解病害和寄主的群体特征，即病 害在田间发生的情况，以及当地的作物栽培及耕 作情况 。 • 初步诊断――通过肉眼观察植株的症状、病原分 泌物以及镜检观察。 • 例如 水稻细菌性条斑病－取一小块病叶组织，低 倍镜下观察，微管束有喷菌现象。
四、染色检验法
• 某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原
菌本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上 特有颜色，利于检出和区分病虫种类
洗涤检验法
• 用于检测种子表面附着的真菌孢子，包括黑粉菌 的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以 及多种半知菌的分生孢子等。
影响洗涤检验的因素
• 种子或其他粮谷类产品表面所黏附的病菌孢子不 一定能完全洗涤下来;