粉蕉愈伤组织的诱导1朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101)E-mail：bsxhhq@摘要：香蕉是一种重要的热带水果。
本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。
其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。
以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。
关键词：香蕉，愈伤组织，诱导中图分类号：S6681. 引言近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。
作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。
由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。
但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。
这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。
本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。
2. 材料与方法2.1 材料选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。
2.2 方法2.2.1 外植体表面消毒剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。
假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。
2.2.2 不同外植体的处理选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。
分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。
1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
2.2.3 不同生长调节剂配比诱导香蕉愈伤组织根据前人报道[1, 6～8]，所有诱导培养基的基本成分均为MS，其处理组合如表1所示。
同时，所有组合均添加生物素(1 mg/L)、麦芽糖提取物(100 mg/L)、谷氨酰胺(100 mg/L)、肌醇(100 mg/L)、烟酸(1 mg/L)、维生素B1(1 mg/L)和维生素B6(10 mg/L)。
表1不同生长调节剂浓度组合（mg·L-1）Table1 combination of different plant hormones (mg·L-1)培养基2,4-D IAA NAA 6-BAK1 2 1 1 0K2 4 1 1 0K3 6 1 1 0K4 8 1 1 0K5 4 0 0 0K6 4 0 0 0K7 4 0 0 0K8 0 0 0.2 4K9 0 0 0.4 6K10 0 0 0.4 4K11 0 0 0.2 6 注：所有培养组合分别在黑暗和光照(4500 lx×12 h/d)中28℃下进行。
2个月后调查愈伤组织诱导情况。
3. 结果与分析3.1 不同来源外植体对愈伤组织诱导的影响从表2可知，从香蕉未成熟雄花花序中诱导出白色、松脆的愈伤组织（图1），这与Navarro等人报道从香蕉花序中诱导出的具有胚性的愈伤组织相同[6]，但愈伤组织诱导率较低仅为1.3%。
同时还可观察到由未成熟雄花花序产生的蓬松而富含水分的愈伤组织，大部分未成熟雄花花序在培养过程中褐化死亡。
在球茎中诱导出大量半透明的愈伤组织（图2），诱导率高达89.1%。
其它类型的外植体培养过程中除部分假茎在K10处理中直接诱导出不定芽外，未见任何的愈伤组织产生。
可见，以粉蕉未成熟雄花花序、球茎为外植体均可获得愈伤组织，但未成熟雄花花序诱导的愈伤组织的胚性能力比球茎的高。
而据Schoofs等报道，从香蕉多芽体茎尖中诱导出愈伤组织[5]。
出现这一现象的原因，一方面可能与所用材料的品种不同有关；另一方面可能与粉蕉植株中内源激素等生理生化物质含量分布不均以及其细胞的分化程度有关。
表2 不同外植体对愈伤诱导率的影响Table2 Effects of different explant on embryogenic callus induction愈伤组织诱导率/%处理号未成熟雄花花序球茎假茎幼叶K10 0 0 0K2 1.3 89.1 0 0K30 0 0 0K40 0 0 0K50 0 0 0K60 0 0 0K70 0 0 0K80 0 0 0K90 0 0 0K100 0 0 0K110 0 0 03.2 不同生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响由表2可知，不同生长调节剂浓度组合中，只有K2处理诱导出愈伤组织，而在其他生长调节剂组合中均未见任何愈伤组织的出现。
Khalil、Navarro和Grapin等人诱导香蕉愈伤组织时均使用了2,4-D[1,6,9]。
由此可确定，2,4-D在诱导愈伤组织中起主要作用。
但由于在只添加2,4-D的培养基中未诱导出愈伤组织，而2,4-D分别与IAA、NAA组合的培养基中也未诱导出任何愈伤组织。
我们认为，IAA、NAA在粉蕉胚性愈伤组织的诱导中共同起着重要作用。
因此，粉蕉愈伤组织的诱导是2,4-D、IAA、NAA共同作用的结果。
这与徐春香等人诱导愈伤组织时所用生长调节剂组合相同[10]。
但据Navarro等人报道，仅用2,4-D 从香蕉(Musa acuminata ssp. malaccensis, AA Group)诱导出了愈伤组织[6]。
而张一凡、夏晶晖等人报道，利用6-BA和NAA可诱导出愈伤组织[7, 8]。
这可能与选用的香蕉品种不同有关。
3.3 不同浓度的2,4-D对愈伤诱导组织的影响本试验针对在诱导愈伤组织中起主要作用的2,4-D进行了分析。
当2,4-D浓度在4 mg/L 时，从香蕉未成熟雄花花序和球茎中诱导出了愈伤组织(见表2)，这一结果与Khalil、Navarro 等人诱导愈伤组织时所用的2,4-D浓度相吻合[1, 6]。
而2,4-D浓度低于4 mg/L或大于4 mg/L 时均未诱导出愈伤组织。
由此可见，在香蕉愈伤组织诱导过程中对2,4-D浓度的变化很敏感。
这一现象可能由于2,4-D浓度低于4 mg/L时不足以影响内源激素等生理生化物质的作用，而当2,4-D浓度高于4 mg/L时虽可显著影响内源激素等生理生化物质的作用，但同时也抑制了其细胞的活性，故也难以形成愈伤组织。
但据徐春香等人报道，用浓度为6 mg/L 的2,4-D从粉蕉幼嫩的雄花中诱导出胚性愈伤组织[10]。
出现这一现象，一方面可能与材料采摘时间有关；另一方面可能与接种材料不同有关即本试验以雄花花序为外植体而徐春香等人则是以雄花为外植体，这有待于进一步实验证实。
另据Navarro等人报道，其在诱导香蕉Musa acuminata ssp. malaccensis胚性愈伤组织时，2,4-D的浓度为1 mg/L[6]，这可能与所用品种不同有关。
因此在诱导香蕉愈伤组织时，2,4-D的浓度应随品种和接种材料的不同而有所变化。
3.4 光暗对胚性愈伤诱导组织的影响本试验中，在4500 lx×12 h/d光照条件下，没有获得的愈伤组织；但在暗培养条件下，则从未成熟雄花花序和球茎中得到了愈伤组织。
这与Khalil、Navarro和Grapin等人在黑暗条件下诱导出愈伤组织结果相一致[1, 6, 9]。
因此在黑暗中更有利于愈伤组织的诱导。
4. 结论以上结果表明，粉蕉愈伤组织的诱导受外植体来源、生长调节剂种类、浓度及光暗的影响。
因此粉蕉愈伤组织的诱导条件为：以粉蕉未成熟雄花花序或球茎为外植体，在MS 培养基上同时添加2,4-D 4 mg/L＋IAA1 mg/L＋NAA 1 mg/L＋麦芽糖提取物100 mg/L＋谷氨酰胺100 mg/L＋生物素1 mg/L＋蔗糖30 g/L＋琼脂粉7 g/L，28℃下暗培养。
以球茎为外植体愈伤组织的诱导率高达89.1%。
但试验中我们发现球茎诱导的愈伤组织的胚性能力较低，针对这一问题我们正对诱导条件进行优化以期提高其愈伤组织的胚性能力。
图1从未成熟雄花上获得的愈伤组织Fig1 Embryogenic callus obtained from immaturemale flowers图2 从球茎上获得的的愈伤组织Fig2 Embryogenic callus obtained from corm 参考文献[1] S.M.Khalil, K.T.Cheah, E.A.Perez, et al. Regeneration of banana (Musa spp. AAB cv. Dwarf Brazilian) via secondary somatic embryogenesis[J]. Plant Cell Reports, 2002, 20(12): 1128-1134.[2] D.Dheda, F.Dumortier, B.Panis, et al. Plant regeneration in cell suspension cultures of the cooking banana cv. 'Bluggoe' (Musa spp. ABB group) [J]. Fruits, 1991, 46(2): 125-135.[3] J.V.Escalant, Teisson C, Cote F. Amplified somatic embryogenesis from male flowers of triploid banana and plantain cultivars (Musa spp.) [J]. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Plant: Journal of the Tissue Culture Association, 1994, 30(4): 181-186.[4] F.X.Cote, R.Domergue, S.Monmarson, et al. Embryogenic cell suspensions from the male flower of Musa AAA cv. Grand Nain[J]. Physiologia Plantarum, 1996, 97(2): 285-290.[5] H.Schoofs, B.Panis, H.Strosse, et al. Bottlenecks in the generation and maintenance of morphogenic banana cell suspensions and plant regeneration via somatic embryogenesis therefrom[J]. InfoMusa, 1999, 8(2): 3-7. [6] C.Navarro, R.M.Escobedo, A.Mayo. In vitro plant regeneration from embryogenic cultures of a diploid and a triploid, Cavendish banana[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1997, 51(1): 17-25.[7] 张一凡. 香蕉组织培养获取试管苗的简易方法及影响不定芽发生因素的研究[J]. 云南教育学院学报，1996，12(2)：70-73.[8] 夏晶晖，鲜敏，杨春艳. 香蕉的组织培养与快速繁殖[J]. 西南园艺，2002，30(3)：3-4.[9] Grapin A, Ortiz J L, Lescot T, et al. Recovery and regeneration of embryogenic cultures from female flowers of False Horn Plantain[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2000, 61(3): 237-244.[10] 徐春香，陈厚彬，李建国，等. 从香蕉胚性细胞悬浮系获得再生植株[J]. 植物生理学通讯，2004，40(2)：161-163.Study on Callus of Fenjiao (Musa spp., ABB) Induction Zhu Jun, Huang Huiqin, Fang Zhe, Bao ShixiangThe Institute of Bioscience and Biotechnology, CATAS, Haikou (571101)AbstractBanana (Musa spp.) is one of the most important food crops in the world. Study on factors which affect induction of callus derived from the banana cultivar Fenjao (Musa spp., ABB group) as follow: source of explants, kinds of plant hormones, concentration of plant hormones, in the dark or light. A best method of callus drived as follow: Explants from immature male flowers or corm were cultured on solid medium including 2,4-D 4 mg/L + IAA 1 mg/L + NAA 1 mg/L and incubated in the dark at 28. Induction rate of callus derived from corm is 89.1%.℃Keywords: banana, callus, induction。