酵母双杂交 噬菌体展示 生物传感芯片质谱 蛋白质工程中的定点诱变技术
新技术
芯 片 技 术
酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system）
1989.Field 和Song等人在酵母细胞中设计的
分析蛋白质相互作用的方法。
以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为 基础的。
转录激活因子GAL4的特点
基本步骤
靶蛋白的制备 蛋白质复合体的纯化 蛋白质复合体的质谱鉴定
（1）亲和层析耦联质谱技术 基本原理
固定蛋白质：（层析柱）
诱饵蛋白质以共价键固定 在基质（如琼脂糖）上
用高盐溶液或 SDS溶液洗脱 结合在柱子上的蛋白质
含有与诱饵相互作用的蛋 白质的细胞裂解液过柱 低盐溶液洗脱 未结合的蛋白质
与诱饵相互作用的蛋白质
P:
DNA结合域载体pGBT9图 ADHI启动子; T: ADHI转录终止信号: GAL4 bd: GAL4转录结合域.
转录因子
启动子 转录激活域 终止信号
在MCR 插入Y基因
P:
转录激活域载体pGAD424图 ADHI启动子; T: ADHI转录终止信号: GAL4 ad: GAL4转录激活域.
蛋白质
RNA
Yeast Three-hybrid system
反向双杂交系统（Reverse two hybrid system）
[乳清苷酸脱羧酶基因~URA3 ]
---反选择筛选策略
原理：
URA3基因的启动子内 引入Gal4的结合位点
改造的酵母菌株
在缺乏尿嘧啶的 选择性培养基上
在含有5-FOA的 完全培养基上
Off
On
转录因子
融合蛋白Y 融合蛋白X
y
x
同时表达
过程
蛋白X,Y相互作用
two hybrid-systems
优势
联系蛋白质表现型和基因型
缺 点
1.假阳性结果筛选cDNA反映体内蛋白质间相互作用 不需分离靶蛋白 敏感性高
2.假阴性结果
3.限于核内表达的蛋白质
二个群间蛋白 质相互作用数
同一功能群中相 互作用的蛋白质
主要应用

筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学 过程和新型的基因治疗导向系统





优点
缺 点
在细菌外完成 限制肽段大小 外源蛋白质无法正确 折叠或修饰
URA3或CYH2
药物干扰
URA3或CYH2 而在5-FOA的完全培养基上生长
缺乏尿嘧啶的选择性培养基上生长
干扰
而在5-FOA的完全培养基上生长
分裂双杂合系统(Split hybrid system)
核外双杂交系统
表达
off
干扰
不表达
on
细菌双杂交系统 原理：百日咳博代杆菌cya基因
编码钙调蛋白(CaM) 依赖性腺苷酸环化酶(cAMPase)
两种重组质粒共同转化 含有报道基因LacZ的细胞株
X-Pr
X-Pr被带到上游位置
转录因子
如果
X-Pr
转录因子
Y-Pr
X-Pr与Y-Pr 相互作用如果
▼ 启动它所调节的基因的转录。 ▼ 报告基因(LacZ)的表达
反映了X与Y相互作用的存在。
酵母双杂交系统
GAL4
转录因子
x
y 报告基因
转录因子
噬菌体表面显示技术 ( phage display )
基本因素 在噬菌体pⅢ和pⅧ衣壳蛋白N端插入外源待筛
基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达在噬
菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天 然构象能被相应的抗体或受体识别。
显示肽or蛋白
噬菌体衣壳蛋白
融 合 蛋 白
编码显示肽or蛋白 的基因
噬菌体病毒
病毒DNA
分别构建含GAL4 BD 和AD 的两个酵母融
转录因子
合蛋白表达载体；
建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的
酵母菌株
Fields等建立双杂交系统
★ 模型: Snf1和Snf2蛋白质~ ~与调控SUC2基因有关 Snf1 融合 形成融合蛋白 “猎物” (prey ) 靶蛋白(target protein) Gal4 DB结构域 Gal4 AD结构域 融合 Snf2
与支持物上的靶（抗体或受体）
铺板 融合蛋白表 达在噬菌体 颗粒的表面
冲洗
扩增挑选的克隆
技 术 方 法
扩增
洗脱
ELISA检验分离的克隆
单链DNA测序,
推导显示肽序列
例
筛选神经节苷脂结合肽 分析糖肽的相互作用随机肽 亲和筛选扩增克隆测序
aa序列 糖脂 结合肽的功能
同感基元
糖与aa的相互作用
搜素糖结合蛋白
利用固相支持物上的抗体或受体，采用体。融合蛋白表达固相支持物
phage display 技 术 方 案
未结合
下一个平板循环 洗涤
外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其
编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来。
激活区两个相对独立的功能片段 T18和T25
引入E.coli DHP1(cya-)作为两独立实体表达
T18和T25
细菌双杂交系统
不能彼此识别与作用 不能互补E.coli DHP1 的cya-缺陷型性能 表现的β-半乳糖苷酶 活性低 在MacConkey麦芽糖 平板上为白色菌落。
若分别与一对有相互作用的蛋 白质融合表达 形成有功能的cAMPase 互补E.coli DHP1的缺陷型 菌株β-半乳糖苷酶活性上升， 平板上为红色菌落。
特征：蛋白X与Y的相互作用
通过第三个分子蛋白Z的参与实现 目的：研究两个蛋白质与第三个成分间的相互作用 [第三个成分：蛋白质、RNA 或小分子药物]
Yeast Three-hybrid system
三杂交系统需要满足的条件 第1、2个融合蛋白必须通过与成分3的结合 间接起到激活报道基因转录的作用
两者间没有直接作用，
Chapter 3
基本技术路线
蛋白质样品的制备 双向电泳 凝胶中的蛋白 图像分析 转印至膜上的蛋白
混合肽
肽指纹图 肽序列质谱数据 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质质量 N端测序
目标
揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调
阐明蛋白质的结构与功能的相互关系，
诠释基因结构与蛋白质结构功能的关系。
裂解细胞
B
A Y
免疫共沉淀蛋白质X
Y
原理
诱饵： 细胞内源性靶蛋白 免疫共沉淀
（immuno-precipitation，IP）
抗靶蛋白抗体
细胞总蛋白
靶蛋白免疫复合物 纯化靶蛋白免疫复合物 凝胶电泳分离
质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白
[例 ]

鼻咽癌细胞系中的p53 相互作用蛋白
抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行 免疫共沉淀
这种光信号可被光感受器接受并转换成电信 号传送到计算机，
再由计算机还原为模拟的生物信号。
小配体
蛋白质 发光
芯片
接收
检测
SPR
定性和定量检测蛋白质之间相互作用
原理：
1. 感兴趣的蛋白固定在葡聚糖聚合物上，构建
所谓~生物传感器
2. 待测蛋白质（肽）溶液流过该固相载体
3. 聚合物表面固定有相互作用的蛋白质
高度的选择性
亲和纯化反应高效性 不需要了解筛选分子结构
融合蛋白可能会影响
到蛋白质本身活性
Dnase I 足纹分析

蛋白质精确结合位点的研究方法。 原理： Dnase I 可以切割DNA中磷酸二酯键，而结 合蛋白质的DNA不能被切割。

方法：选择性末端标记DNA片段，加入蛋白质形成复 合物，后加入Dnase I ，形成1个碱基的梯度，而蛋 白质结合部位，留下空白。
蛋白质翻译后修饰的研究
翻译后修饰
糖 基 化
乙 酰 化
甲 基 化
羧 基 化
二 硫 键
面临的困难
修饰肽的检测的高灵敏度方法
蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件
测定工作量巨大
蛋白质相互作用
生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序 和协同作用
新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作
不能直接激活报告基因的转录 成分3具有分别与第1，2个融合蛋白结合的区域
A 配体的受体-1 DNA结合区
B
转录激活区 配体的受体-2
X-3
报告基因 操纵子
原 理 示 图
1
间接作用
2
X-3
报告基因
操纵子
应用~药物
药物
结合位置不同
Yeast Three-hybrid system
应用~Pr/RNA
多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS） 鉴定靶蛋白的结合蛋白。
先决条件
得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋 白作为诱饵（bait） 获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用
的蛋白质
利用含靶蛋白的融合蛋白获得
相互作用蛋白质
重 组 靶 蛋 白

谷胱甘肽S转移酶融合蛋白
（glutathione S-transferase，GST）
用实现
细胞信号转导及病原体感染和免疫反应
ห้องสมุดไป่ตู้
蛋白质相互作用方式
一、蛋白质－蛋白质 二、蛋白质－核酸间相互作用研究
蛋白质－蛋白质
蛋白质-蛋白质相互作用的形式 1、蛋白质亚基的聚合
2、交叉聚合
3、分子识别 4、分子的自我装配 5、多酶复合体