——PCR扩增出包含突变位点的特定片段 ——利用突变位点特异的限制性内切酶消化ABO基因扩增产 物 ——特定的片段经凝胶电泳检测便能获得ＳＮＰ的特征 ——以ＳＮＰ组合的方式鉴定ＡＢＯ基因型。
PCR－SSP
• 目前最常用的基因分型技术，PCR 扩增产物通过凝 胶电泳进行分析。
• 根据基因座特异的SNP特征设计相应的序列特异性 引物
常见A亚型的分子基础
常见B亚型的分子基础
cisAB与B（A）的分子基础
• 极少数人类个体的一条染色体中同时存在一个
cisAB或B（A）基因，它编码的酶可以同时催化
A抗原和B抗原的合成。
• cisAB或B（A）是从一个亲本遗传而来的，因此 即便其基因型是cisAB / O或 B（A） / O，也会表
• PCR扩增产物的有无是鉴定特异性等位基因的基础
• 本法也存在一定假阳性率，有学者选择在SSP的３′ 末端即SNP位置的倒数第２或第３个位置上设计错 配以提高引物的扩增特异性。
• 注意选用不具外切酶活性的TaqDNA聚合酶，否则 容易出现假阳性扩增。目前有单管扩增的PCR检测 模式，也有多重PCR同管扩增的模式
• 结论：CisAB*01/O
谢谢！
——没有血液系统的疾病, 正定型在试管法中应 该有“ 4 +”强度的凝集, 否则极有可能是ABO亚型
——反定型, 凝集强度<2 +, 甚至仅存在冷反应 性不规则抗-A或抗-B, 这也提示有可能存在亚型。
ABO亚型
正定型的凝集强度与凝集状态 •A2 亚型与合格的人源抗-A试剂反应, 可以达到4 +, •Ax形成的凝集一般≤ 2 +, •混合视野凝集中凝集的红细胞≥ 50%, 通常判定为 A3 或B3 型, •混合视野凝集中凝集的红细胞<10%, 则通常判定为 “Aend”或“ Bend”。 •部分亚型红细胞和抗体在4 ℃放置10-30 min后, 凝 集强度会显著增强
ABO血型亚型与突变基因关系
• 血清学检测易受主客观因素的影响，常常遇到和任何现有 亚型血清学特点均不能完全相符的情况，在没有确切的证 据证明为1种新的ABO亚型之前，根据其主要的血清学特 点,，将其纳入现有的亚型框架
• 合理的定义ABO亚型，可以使我们大致了解该1份血标本 表达的ABO抗原强度, 是否存在或容易产生不规则抗-A、 抗-B及抗-H, 是否存在相应血型物质等线索, 对其临床意义、 遗传特性的判断等也能提供很有意义的信息
V
_
times.
+
A3
++mf _
++mf _
+++ Occa- _
V
_
sionall
y. +
Am
-/w+ _
-/w+ _
V
_
_
V
_
Ax
-/W+ _
+/++ _
V
Fre-
_
V
_
quentl
y+
Salivaof secretors
A and H A and H A and H A and H A and H H
各种A亚型血清学表现
Phenotype Red cells tested With anti-sera
Anti-A -B
-AB
-A1
-H
Serum tested with Known red cells
A1
A2
B
O
A1
V
_
V
V
_
_
_
V
_
Aint
+++
_
V
++
+++ _
_
V
_
A2
+++
_
V
_
++ Some- _
B/O individuals 700C 703A/G
nt640 nt641
Normal B 101 allele
B(A) 640A>G allele Genbank accession: DQ124679
B(A) 641T>C allele Genbank accession: DQ124678
清、尿液、精液和羊水等中 • ABO血型抗原存在发育的过程
成人与新生儿ABO抗原数量比较
细胞 成人
新生儿
A1 810 000－1170 000 250 000－ 370 000
A2 240 000－ 290 000 140 000
B 610 000－ 830 000 200 000－320 000
ABO血型分子基础与应用
江西省血液中心 李国良
ABO血型基本知识
• Landsteiner 1900年发现ABO血型 • ＡＢＯ是目前35个血型系统中最为重要的一个血
型系统 • ４种表型抗原：Ａ、Ｂ、Ｏ、ＡＢ • ABO血型抗原主要分布在红细胞上，同时分布在
白细胞、血小板和组织细胞上 • 分泌型ABO血型抗原为半抗原，分布在唾液、血
ABO血型基因
• ABO基因的参比序列：A*101 • 在A1基因的基础上核苷酸突变糖基转
移酶改变影响催化活性抗原改变 • A和B基因ｃDNA序列有7个碱基不同，其
中４个引起氨基酸的替换，分别是176、 235、266和268 • O基因在261位单碱基缺失造成移码突变， 终止密码提早出现，其它序列与A相同
现为AB型，若与O型血的人（基因型O / O）生育， 子女的血型可能是AB或O，而不像通常AB型血与 O型血的父母只能有A或B型血的子女。
cisAB与B（A）的分子基础
CisAB与B（A）——4个关键位置氨基酸替代 A糖基转移酶: AAAA B糖基转移酶: BBBB cisAB酶： AAAB ；BBAB等 B(A)酶：BABB ；BBBB等
中国汉族群体ABO基因分布
O/B基因杂交产生Ax表现型
母亲B型，父亲O型，孩子A型，属于明显的一级父源排除关系。Suzuki et al.提 出母亲生殖细胞系形成时发生B和O1等位基因交换，形成B-O融合基因，编码一 个有A转移酶活性的基因产物，因为第7外显子来自O1基因，与A1基因第7外显 子具有相同的序列。
PCR—SSP
ABO基因测序
• 通过PCR扩增基因的主要片断，对产物进 行序列分析，对照标准基因片断，分析基 因突变的碱基以确定血型
• 结果准确可靠 • 需要特殊的仪器设备 • 操作复杂，成本高
一个带有B(A)700C>G突变的 B(A)02家系
B(A) 02 (700C>G)
700G
703 A
1.6
0.6
ABO亚型的分布
• Aint可以看做是A1 和A2型的过渡型, 数量多于A2 型
• 除去A1、Aint、A2 型之外, 其他ABO亚型相当罕 见, 根据现有数据, 在我国约为1.5/1万或略多, 而 且B亚型的数量明显多于A亚型
• 类孟买型在我国不同区域人群中的分布比例约为 1/8 000— 1/16 000
ABO血型基本知识
• ＡＢＯ血型抗原为糖蛋白和糖脂构成的多态性多 糖链
• ABO血型抗原的蛋白结构：前体物质+H物质(L岩 藻糖）+/-特异性糖（N-乙酰半乳糖胺/D-半乳糖）
ABO血型鉴定
ABO亚型
发现ABO亚型 • ABO血型鉴定时正反定型不符 • 正反定型是相符的, 但某些反应的强度较弱
ABO血型基因的临床应用
作为个体特异性的遗传标志物
——用于ＡＢＯ血型不合造血干细胞移植后嵌合体 监测，指导ＡＢＯ血型不合移植后临床输血支持治 疗 ——家系遗传学分析
ABO血型基因检测技术
• 核心技术：聚合酶链反应 • PCR-RFLP • PCR-SSP • DNA序列测定
PCR－RFLP
原理：
ABO基因在cDNA和氨基酸上的差异
•A1 allele (A*101) •A1 allele (A*102)nt467(C→T)=>aa156(pro→leu) •B allele nt291(A→G)；
nt526(C→G) =>aa176(Arg→Gly)； nt657(C→T)； nt703(G→A) =>aa235(gly→Ser)； nt796(C→A) =>aa266 (leu→Met)； nt803(G→C) =>aa268(Gly→Ala)； nt930(G→A)。 •O allele (O*101) nt261(G→del) =>framshift •O allele (O*102) nt261(G→del) =>framshift , nt297(A→G), nt646(T→A), nt681(G →A), nt771(C→T), 829(G→A)
A3 Aend Ax Am
Ay
Ael
ABO亚型的分布
最常见的ABO亚型存在于A型人群中, A型个体大多数属于A1 型, 少数属于Aint、A2 型。
A2或 A2B 在人群中的分布（占 A 型或 AB 型的%）
欧洲 南非
亚洲
白人和黑人 黑人 中国上海
日本
韩国
A2 22
43
0.5
A2B
4
0.1
0.02
血学方法与DNA技术相互补充
• 一个CisAB核心家系
A2Bx (CisAB/O)
O (OO)
A2Bx (CisAB/O)
A2Bx (CisAB/O)
O (OO)
• 血清学：A2Bx • 基因分型：A*102/O • 序列测定：