青霉菌的原生质体制备技术研究薛康平任富亮邢建广王越甲摘要：实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28℃, 培养42h，蜗牛酶的浓度为5mg/ml，酶解3.5h ，酶解温度33℃ ,稳定剂采用0.7mol/LNacl，此条件下能够制备最大量的青霉菌原生质体。
关键词：青霉菌原生质体蜗牛酶1原生质体简介细胞壁被酶水解剥离，剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体Weibull 等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞获得原生质体。
其形状随不同菌类而异，革兰氏阴性菌经酶水解后细胞壁尚有残余部分，细胞具刚性，保持球形，称为原生质球或球质体；革兰氏阳性菌细胞壁去除彻底，失去刚性，原生质体类似于球体。
不论原生质体或原生质球都基本保持原细胞结构，活性和功能，只是因为它们去掉了细胞壁，对渗透压特别敏感。
原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术，它是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌（Micromonospora rosaria）取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素，酶制剂，有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。
丝状真菌原生质体的提取方法有三种：机械法，非酶分离法和酶法。
采用前二种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于一些特定菌株，因此并未得到推广。
在实际工作中，最有效和最常用的是酶法，该法时间短，效果好。
到目前为止，适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用。
酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度，pH值等）酶解细胞壁[7]。
酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤，除去大部分菌丝碎片。
滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。
酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应，作为底物的细胞壁，其组成与结构又与培养基成分，培养条件，菌齢和预处理等因素有关。
2 材料与方法2.1 材料2.1.1 菌株青霉菌，来自河北科技大学（生物科学与工程学院微生物实验室保藏菌株）2.1.2 培养基马铃薯低渗培养基马铃薯等渗培养基（即含0.7mol/l NaCl的上述培养基）2.1.3 试剂蜗牛酶，石炭酸复红染色液，蔗糖，KH2PO4.7H2O，MgSO4，酵母膏， NaCl。
2.1.4 仪器与设备（1）IA-1003电子天平,TGL-16C台式离心机，光学显微镜，超净台，恒温箱，电磁炉，4℃冰箱，高压灭菌锅。
（2）移液枪及枪头，1.5ml离心管，小医用注射瓶，100ml量筒，锥形瓶，培养皿，烧杯，镊子，酒精棉球，绳子，接种针，封口膜，报纸。
2.2 方法2.2.1配制马铃薯低渗培养基（1）称取土豆434.97g，切成小块，放入锅中煮。
用纱布过滤除去土豆泥，得到土豆汁500ml。
（2）称取2g蔗糖，0.5g KH2PO4.7H2O、0.5g MgSO4、1.5g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出160ml一并放入烧杯，再加水至500ml。
（3）取100ml于锥形瓶中，加入2g琼脂，其余的分装入3个锥形瓶。
（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。
（5）灭完菌后，固体培养基倒平板，液体培养基放入4℃冰箱保存。
2.2.2配制马铃薯等渗培养基（1）称取0.4g蔗糖，0.1g KH2PO4.7H2O、0.1g MgSO4、0.3g酵母膏放入烧杯中，从原土豆汁中取出32ml一并放入烧杯，再加0.7mol/l的Nacl至100ml。
（2）称取2g琼脂放入烧杯中。
（3）混匀后分装入5个锥形瓶。
（4）做好标记，与培养皿一起放入高压锅中灭菌。
2.2.3 配制不同浓度的蜗牛酶液(1)称取20mg蜗牛酶于小医用注射瓶中，并加水至2ml，此即为浓度10mg/ml 的蜗牛酶液。
(2)从上述酶液中分别取80、240、400、560、720于小医用注射瓶中，并补水至800ul。
(3)此即为浓度分别为1、3、5、7、9mg/ml的蜗牛酶，用记号笔做上标签。
2.2.4 配制0.7mol/l Nacl溶液称取32.76gNacl固体溶于无菌水中，定容至800ml，灭菌并4℃保存。
2.2.4 青霉菌菌株的活化将保存在冰箱中的青霉菌接种在新配制的马铃薯固体培养基中。
28℃恒温箱中培养2-3d。
2.2.5 原生质体制备(1) 接种：培养好后，从平板培养基中，取一环菌接种于马铃薯液体培养基中，33。
C恒温摇床分别培养36h、42h、48h。
(2)离心：将培养好的青霉菌在12000r/min下离心5min.(3)洗涤: 弃上清液，将沉淀用0.7mol/L Nacl洗涤两次。
(4)酶解：将洗涤完后每个培养时间的青霉菌分装于5个小离心管中，每管60mg新鲜菌丝体，向这些离心管中分别加入0.6ml浓度为1mg/ml、、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的蜗牛酶。
33℃振荡培养3.5h.(5)过滤：酶解液用4层擦镜纸过滤，滤去未酶解的菌丝。
(6)离心：滤过液4000r/min离心10min,收集原生质体。
(7)洗涤：所得沉淀用0.7mol/L的Nacl洗涤离心三次，用等量的0.7mol/L的Nacl悬浮原生质体。
(8)观察并计数：在显微镜下观察原生质体的形态并计数。
3 结果与讨论3.1 不同浓度蜗牛酶酶解条件不同浓度蜗牛酶酶解条件下得到的原生质体如下：图1 1mg/ml蜗牛酶图2 3mg/ml蜗牛酶图3 5mg/ml蜗牛酶图4 7mg/ml蜗牛酶图5 8mg/ml蜗牛酶液体培养36h以上实验的结论是5mg/ml的蜗牛酶的效果最好3.2 菌龄对青霉菌原生质体形成的影响以5mg/ml蜗牛酶处理青霉菌，考察了培养时间对原生质体形成的影响结果如下：图6 液体培养36h图7 液体培养42h图8 液体培养48h 图9液体培养54h 液体振荡培养42h的青霉菌原生质体的得率最高。
这可能是因为菌体的不同生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。
青霉菌原生质体制备一般取对数生长期的细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致。
对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构对降解酶不敏感，酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解，造成菌丝体断裂，内含物溢出。
到了对数生长后期，菌丝体原生质体释放量较高，但菌丝体体内有大量液泡产生，且原生质膜内皱较多，故释放的原生质体体积较大。
4 小结确定了丝状真菌——青霉菌原生质体形成最佳的部分条件是用马铃薯液体培养基，液体震荡培养温度28℃, 酶解3.5h ，酶解温度33℃ ,不用预处理，稳定剂采用0.7mol/lNacl。
本次实验分别从菌龄、蜗牛酶的浓度等方面研究了提取丝状真菌——青霉菌原生质体的最优条件。
所得结论如下：1.菌龄对青霉菌原生质体提取存在着比较大的影响。
在相同的培养条件下，通过比较液体摇床震荡培养36h、42h、48h的青霉菌，得出的结论是：培养42h的青霉菌释放原生质体的数量最大。
2. 蜗牛酶浓度对青霉菌原生质体提取也存在着比较大的影响。
在相同的培养条件下，通过比较1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的蜗牛酶浓度对原生质体形成的影响，得到的结论是：蜗牛酶的浓度为5mg/ml时，能制备最大量的原生质体。
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