. 整理版 IHSS定性提取方法 称取过2mm筛风干土样100g加入玻璃瓶(2.5L玻璃瓶①)中, 按土水比1:1加入1mol/L的HCl(如仍冒泡则按1:2), 放置1h, 用0.1mol/L的HCl调至最终土水比1:10. 室温摇动玻璃瓶1h(10min/次), 将混合液倒入大离心管中, 低速离心, 上清液(FA1)倒入FA瓶(2.5L塑料瓶)中备用. (1D) 碱提步骤：用0.1mol/L的NaOH将沉淀冲到玻璃瓶①中, 并调至最终土水比1:10，用1mol/L的NaOH调节pH=13~14, 立即充氮气(1min)并盖严. 保持氮气条件下(盖严)摇动玻璃瓶, 1h或0.5h一次, 持续12h后静置过夜. 次日低速离心, 上清液倒入HE(HA+FA2)瓶(2.5L玻璃瓶②)中, 用6mol/L的HCl将HE瓶中液体酸化(pH=1.0). 碱提步骤(下划线)重复3次. 重复3次后将沉淀水洗至适当容器中, 50℃烘干, 以提取Hu备用(Hu提取完毕). 絮凝步骤：第三次酸化后的HE放置12~16h, 用虹吸法将上清液(FA2)吸入FA瓶, 之后低速离心, 上清液为FA2(虹吸残留), 将上清液倒入FA瓶中(FA提取完毕), 沉淀为HA. 氮气条件下在大离心管中用最少量(记录所用体积)0.1mol/L的KOH溶解HA, 之后用适量1mol/L的KOH调节pH=13~14. 加入计算好的固体KCl (KCl用量见附表1), 使K+浓度为0.3mol/L(如无絮凝则需微量添加), 静置1h后, 将溶液移至高速离心管, 高速离心, 保留上清液, 弃掉悬浮物. 酸洗步骤：搅拌条件下用6mol/L的HCl调节上清液pH=1.0, 放置12~16h, 高速离心后弃掉上清液. 在高速离心管中用30ml的HCl(0.1mol/L)+HF(0.3mol/L)【8.3mL HCl+24.87mLHF→1000mL】浸泡HA, 室温下振荡过夜后高速离心, 弃掉上清液. 酸洗步骤(斜体)重复3次. 必要的话，洗至灰分含量小于1%.

用水将沉淀搅拌成泥状, 之后电渗析直到蒸馏水中无Cl-(AgNO3检测), 冻干备用(HA提取纯化完毕). 注解 注1: ①和②为玻璃瓶组号 注2: 室温条件为25℃ 注3: 低速离心为4000r/min, 15min, 离心管为大离心管, 250ml 注4: 高速离心为11000g, 15min, 离心管为高速离心管, 30ml 所需药品 . 整理版 1、盐酸HCl : 0.1mol/L（8.3mL→1000mL）, 1mol/L, 6mol/L（500ml→1000mL） 2、氢氧化钠NaOH: 0.1mol/L, 1mol/L 3、固体KCl 4、氢氧化钾KOH : 0.1mol/L （5.6g→1000mL） 5、氢氟酸HF : 0.3mol/L （24.87 mL→1000mL） HCl(0.1mol/L)+HF(0.3mol/L)【8.3mL HCl+24.87mLHF→1000mL】

附表1 0.1M KOH=0.4L 0.1M KOH=0.5L 0.1M KOH=0.6L 0.1M KOH=0.7L 1M KOH(L) KCl(g) 1M KOH(L) KCl(g) 1M KOH(L) KCl(g) 1M KOH(L) KCl(g) 0.010 4.088 0.010 5.208 0.010 6.328 0.010 7.448 0.020 3.696 0.020 4.816 0.020 5.936 0.020 7.056 0.030 3.304 0.030 4.424 0.030 5.544 0.030 6.664 0.040 2.912 0.040 4.032 0.040 5.152 0.040 6.272 0.050 2.520 0.050 3.640 0.050 4.760 0.050 5.880 0.060 2.128 0.060 3.248 0.060 4.368 0.060 5.488 0.070 1.736 0.070 2.856 0.070 3.976 0.070 5.096 0.080 1.344 0.080 2.464 0.080 3.584 0.080 4.704 0.090 0.952 0.090 2.072 0.090 3.192 0.090 4.312 0.100 0.560 0.100 1.680 0.100 2.800 0.100 3.920 0.110 0.168 0.110 1.288 0.110 2.408 0.110 3.528 0.120 0.896 0.120 2.016 0.120 3.136 0.130 0.504 0.130 1.624 0.130 2.744 0.140 0.112 0.140 1.232 0.140 2.352 0.150 0.840 0.150 1.960 0.160 0.448 0.160 1.568 0.170 0.056 0.170 1.176 0.180 0.784 0.190 0.392 0.200 0.000

（1）将粗HM烘半干、称重，均匀分成4份，置于离心管（100mL）中，加入0.5%(v/v)的HF-HCI混合液约50ml,用玻璃棒搅匀,在恒温（水浴）振荡机上振荡12小时(25℃,145-175rpm/min)，次日取出离心15分钟(3500r/min),然后将离心后的上清液弃去,继续重复上述处理6次，即依次用0.5%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理7次。 （2）用2.5%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理7次；振荡、离心同上。 （3）用5%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理11次; 振荡、离心同上。 （4）用10%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理6次，振荡、离心同上。 （5）用20%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理4-8次; 振荡、离心同上。 （6）用30%(v/v)的HF-HCI混合液连续处理2次; 振荡、离心同上。 . 整理版 （7）用40%(v/v)的HF-HCI混合液处理1次，振荡、离心同上。 总共用不同浓度的HF-HCI混合液处理33-37次，前8次分别向每个离心管加入4gNa2SO4·10H2O，将经HF-HCI混合液处理后的HM用蒸馏水(25-50ml/管)洗至无氯离子反应(共洗3-6次，用AgNO3检查),然后用冷冻干燥机冻干备用。

定量：腐殖质组成修改法（包括胡敏素提取） （1天）提取： 1、称取风干土（60目）5.00g于100ml离心管（事先标号称重），土用百分之一天平称。 2、按照土比水1/6加入蒸馏水（即30ml,用注射器，20+10ml ）。 3、搅拌均匀后，用恒温水浴振荡器（70±2度、145转/分）震荡提取1h。 4、取下后以3500转/分离心15分钟，将上清液用中速定量滤纸过滤到50ml容量瓶中。 5、再用蒸馏水洗残渣1次（10+10）ml 将离心液过滤到50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，此部分为水溶性物质——WSS. （WSS测吸光值400、465、600、665nm用723可见光分光光度计，做TOC. ） 分离： 一、HE（HS）与HM的分离 1、离心管中残渣加入（20+10）ml 0.1N NaOH与0.1mol/L Na4P2O7•

10H2O(pH=13)混合液，玻璃棒搅拌均匀。

2、在恒温水浴振荡器上70±2度145转/分震荡，提取1h。 3、取下后，以3500转/分离心15分钟，将上清液用中速定量滤纸过滤到50ml容量瓶中。 . 整理版 4、再用混合液洗残渣1次，（10+10）ml，将离心液过滤到50ml容量瓶中，蒸馏水定容，此为可提取腐殖物质——HE 5、离心管中的残渣用（20+10）ml蒸馏水洗2-3次并3500转/分离心15分钟，弃去液体，此时离心管中为胡敏素——HM（Hu）（粗）. 二、HA与FA的分离 1、吸取上述碱提取液(HE)30ml于50ml小三角瓶中，加入1N H2SO4

,调节

pH为1.0-1.5。(加4管左右酸，溶液颜色会变化) 【HE取出30ml后剩余约10ml先不倒掉，以备TOC仪器故障时，取5ml，电热板定碳（先中和、蒸干、定碳）。FA=HE-HA】 2、将此溶液于60-70度（67）下水浴锅中保温1-2h,然后静置过夜。 （2天） 3、次日，将溶液用中速定量滤纸过滤，分离出沉淀为HA,溶液为FA 用水定溶（FA测吸光值，上TOC）。吸FA 10ml于50ml容量瓶中，调ph为7，定容，可测TOC,TOC小瓶装满排号） 4、用0.05N H2SO4

洗涤沉淀（HA）3次于50ml锥形瓶中，每次用5-8ml

（7.5ml）（注射器），弃去洗液。 5、将HA沉淀用温热的(60度，最好在水浴锅旁恒温加热冲洗)0.05N NaOH溶解于另一组50ml容量瓶中（3次，20+10+10ml），用0.05N NaOH定容——HA(HA测吸光值，稀释5-10倍.上TOC). 如TOC仪器故障时，取5-10ml，电热板定碳（先中和、蒸干、定碳）。FA=HE-HA】

三、HMi与HMc的分离 1、粗HM用(15+10)ml 1N H2SO4

搅拌25°C振荡2h,以4000r/min离心