思考题
1、碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪 些问题？溶液Ｉ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的 作用？ 2、描述质粒DNA的电泳图谱，并解释 产生的现象及可能的原因？
材料、设备及试剂
一、材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20µl,200µl,1000µl)， 台式高速离心机，恒 温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电 泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
DNA双链 双链
变性 强碱 中性 复性 DNA单链 单链
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 ， 闭合环状的质粒 分离，复性快； 分离，复性快；
染色体线性 和或有缺口 染色体线性DNA和或有缺口的质粒 线性 和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 变性后双链分离， 变性后双链分离 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 缠绕的结构，与蛋白质 复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
三、试剂 1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母 提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调 pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。 2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保 存备用。 4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分 装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。 5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋 酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。 6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟, 储存于4℃冰箱。 7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用5-10mol/L NaOH母液稀释)，1 ％ SDS。 8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至 100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac¯ 5mol/L。
操作步骤
一、 细菌的培养和收集
将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50µg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50µg/ml Kan)中,37℃振荡培养约12小时至对 数生长后期。
质粒DNA少量快速提取 二、 质粒 少量快速提取
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化 的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同 时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳 分析的需要。
（二）、碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下10000rpm离心 5min。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于150µl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分 钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ300µl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管 数次,以混匀内容物(千万不要振荡 千万不要振荡),冰浴5分钟。 千万不要振荡 5、加入227µl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒, 使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),颠倒混 匀, 4℃下12000g离心5分钟，重复一次。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠倒混 匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul 70％ 乙醇洗沉淀两次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽, 室温干燥。 10、将沉淀溶于20-50µl 无A比质粒大得多,受机械力后细 菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕 附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒 DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快 于细菌染色体DNA。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括 3个基本步骤:
1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细胞 3、分离和纯化质粒DNA
（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min， 充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中， 加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20µl无菌水溶解 DNA。
（一）、煮沸法 试验步骤：
• 将振荡过夜培养的细菌1.5ml ，于8 000r/min离心1min， 弃上清液。 • 将沉淀回溶于350µL STET (0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。)中。 • 加入25µL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于 10 000r/min离心10min。 • 吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签 小心地将沉淀去除，加入 40µL2.5mol/LNaAc（PH5.2） 和420µL冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。 • 12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次， 然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。 • 用20µL无菌水溶解沉淀，于－20℃冻存
变性
煮沸法： 煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁 的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂 解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分 离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相 缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心 除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中 回收质粒DNA
实验目的：
1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方 法、 煮沸法、小量一步提取法这三种质 粒DNA的提取方法。 2、三种方法的比较，能够根据不同的 实验目的选择合适的方法。
实验原理：
碱变性原理 ： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性 DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0∼12.5 这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而 被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒 DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍 会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐 缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经 过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
基因工程原理与技 术实验部分：
质粒三种提 取方法的比 较
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子 染色体外的稳定遗传因子, 染色体外的稳定遗传因子 大小从1-200kb不等 为双链、闭环的 不等,为双链 分子,并 大小从 不等 为双链、闭环的DNA分子 并 分子 以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现 以超螺旋状态存在于宿主细胞中 于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制 和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并 表达所携带的遗传信息。
[注意 注意] 注意
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量 除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时 间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一 般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提 在细菌细胞内 共价闭环质粒以超螺旋形式存在。 共价闭环质粒以超螺旋形式存在 取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的 取质粒过程中，除了超螺旋 外 质粒DNA。如果质粒 质粒 。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多 两条链中有一条链发生一处或多 处断裂,分子就能旋转而消除链的张力 分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状 处断裂 分子就能旋转而消除链的张力 形成松驰型的环状 分子,称开环 称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如 分子 称开环 ； 果质粒DNA的两条链在同一处断裂 则形成线状 的两条链在同一处断裂,则形成线状 果质粒 的两条链在同一处断裂 DNA(Linear DNA)。当提取的质粒 电泳时,同一质粒 。当提取的质粒DNA电泳时 同一质粒 电泳时 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动 速度快。 速度快。
9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及 导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基 喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下 DNA会分配于有机相。 11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有 助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积 /体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性， 操作时应戴手套。 12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压 灭菌后储存于4℃冰箱中。 13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。 14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g， 并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)： 0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。