《生物反应工程》实验讲义及实验报告班级：学号：姓名：成绩：实验一游离酶与固定化酶酶学性质比较实验目的：掌握测定酶动力学参数的实验方法，作图法计算酶动力学参数，掌握固定化酶的方法，以及固定化酶后动力学参数的变化。

实验原理：要建立一个完整的酶动力学方程，必须要通过动力学实验确定其动力学参数。

对M—M方程，就是要确定r max和K m值。

但直接应用M—M方程求取动力学参数所遇到的主要困难在于该方程为一非线性方程。

为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。

通常有下述几种作图方法。

Lineweaver—Burk法(简称L-B法)。

将M—M方程取其倒数得到下式：(1)以1／r s对1／C s作图可得一直线，该直线斜率为K m／r max，直线与纵轴交于1／r max，与横轴交于一1／K m。

此法又称双倒数图解法。

Hanes—Woo1f法(简称H—W法)。

将式(1)两边均乘以Cs得到(2)以C s／r s对C s作图，得一斜率为1／r max的直线，直线与纵轴交点为K m／r max，与横轴交点为一K m。

(3)Eadie—Hofstee法(简称E-H法)。

将M—M方程重排为（3）以r s对r s／C s作图，得一斜率为一K m的直线，它与纵铀交点为r max，与横轴交点为r max／K m。

固定化酶亦称固相酶或水不溶酶。

它是通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全约束、或受到局部约束的一种不溶于水，但仍具活性的酶。

它能以固相状态作用于底物进行催比反应。

固定化酶的主要优点是，在催化反应以后很容易从反应系统中分离出来，不仅固定化酶可以反复使用，而且产物不受污染容易精制，固定化后的酶大多数情况下其稳定性增加，仅有少数的稳定性下降，固定化酶有一定的形状和一定的机械强度，可以装填在反应器中长期使用，便于实现生产连续化和自动化。

固定化酶的制备方法可分为吸附法、交联法、共价法、包埋法四大类。

如果固定化酶的动力学仍服从M—M方程，则可通过动力学参数K m与r max值的大小来反映酶在固定化前后活性的变化。

仪器与试剂：分光光度计、水浴锅、酸性磷酸酯酶、磷酸苯二钠、酚标准液、碳酸钠溶液、费林－酚试剂、卡拉胶实验步骤及数据记录：1、酚标准曲线的绘制。

取9只试管，按照0-8的顺序编号，0号为空白管。

按照下表的过程进行操作：管号0 1 2 3 4 5 6 7 80.4mmol/L酚标准液0 mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8蒸馏水 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1mol/L碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 费林－酚试剂0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.535℃显色10minA6802、酶动力学参数的求取。

取7只试管，按照0-6的顺序编号，0号为空白管。

按照下表的过程进行操作：℃管号0 1 2 3 4 5 65mmol/L磷酸苯二钠溶液0 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.50.5 0.4 0.45 0.3 0.2 0.1 00.2mol/LpH5.6乙酸盐缓冲液酶液0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.535℃反应15min1mol/L碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 费林－酚试剂0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.535℃显色10minA6803、酶固定化及动力学参数测定。

称取0.8g卡拉胶，溶解在20mL水中，加热煮沸，冷却到50-60℃。

将在水浴锅中保温好的酶液5mL倒入，并搅拌均匀，冷却，待完全固化后，用5%的KCl 溶液浸泡30 min。

将浸泡好的固定化酶取出，滤纸吸干，用小刀将其切成3×3mm的小块。

称取固定化酶5g共6份，取6只50mL三角瓶，按照下表过程操作：三角瓶号0 1 2 3 4 55mmol/L磷酸苯二钠溶液0 1 3 5 7 90.2mol/LpH5.6乙酸盐缓冲10 9 7 5 3 1液固定化酶 5 5 5 5 5 535℃摇床反应15min1mol/L碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2费林－酚试剂0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.535℃显色10minA680实验结果处理分析：绘制酚标准曲线计算游离酶动力学参数CsA680酚含量r s1/Cs1/r sCs /r sr s /Cs计算固定化酶动力学参数CsA680酚含量r s1/Cs1/r sCs /r sr s /Cs游离酶和固定化酶酶活力比较：游离酶方法L-B H-W E-H参数K m r max K m r max K m r max固定化酶方法L-B H-W E-H参数K m r max K m r max K m r max酶活回收率有效因子分析和讨论：1、动力学参数作图法求取的方法有那些？分别考虑其误差来源。

（预习时填写）2、固定化酶的方法有那些？本实验中采用的方法是什么？有什么优点？实验二用亚硫酸钠氧化法测定气液接触过程的体积传质系数实验目的：在非发酵情况下，用亚硫酸钠氧化法来测定发酵罐通气或搅拌时的体积传质系数，从而考察通气、搅拌等因素对发酵罐内气液接触过程的体积传质系数的影响。

仪器与试剂：1、发酵罐（搅拌或气升式）2、碘量瓶3、移液管（1mL）4、烧杯（50mL、2000 mL）5、0.1mol·L-1碘液6、0.1 mol·L-1硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液7、无水亚硫酸钠8、硫酸铜实验原理亚硫酸钠溶液，在铜或钴离子作为催化剂的作用下，能与液相中的溶解氧迅速反应，使亚硫酸根离子氧化为硫酸根离子，其氧化反应速度在较大范围内与亚硫酸根离子浓度无关。

由于氧是较难溶解于水的气体，因而氧的溶解速度要比液相中的氧的消耗速度慢的多，因此氧分子一经渗入液相，就立即被还原，所以可以认为，在整个实验中，液相中的氧浓度可视为零，即有：在25℃及0.1MPa下，亚硫酸钠溶液中，经测定C*=0.21mgO2·L-1。

所以从上式可以看出，只要测得值，就可以计算出。

实验时，在搅拌罐中配制一定浓度的亚硫酸钠溶液，其体积视发酵罐的大小而定；在搅拌通气或通气情况下，加入少量催化剂，计时，取不同时刻的试样与过量的碘溶液作用，多余的碘用表定过的硫代硫酸钠来滴定，根据消耗的硫代硫酸钠溶液的体积，可以计算出单位时间内氧的溶解量值。

上述过程的反应式如下：实验步骤：1、发酵罐清洗，试运转，（对气升式发酵罐要确定其最佳装液量）2、装罐实验：准确称取31.5g亚硫酸钠，放置烧杯中，用1L水溶解，待亚硫酸钠全部溶解后，倒入发酵罐中；准确称取0.5g硫酸铜并溶解于少量水中，将硫酸铜溶液倒入发酵罐中；在室温下，开动搅拌通气或通气搅拌，调节搅拌转速n和通气量Q；开始计时，每隔一定时间（5min）取样1mL分析其中的亚硫酸钠含量（取5个样），测定其中的亚硫酸钠含量。

调节通气量或搅拌转速，重复上面的实验，要求改变实验条件，做3个条件实验。

数据记录：实验结果记录表按照记录数据进行绘图：数据处理：按照上面的数据，计算和条件转速：气量：转速：气量：转速：气量：转速：气量：转速：气量：转速：气量：）（）（绘制转速n和关系图，或气量Q和关系图分析和讨论：3、讨论分析转速、通气量、亚硫酸钠浓度等因素对发酵罐体积传质系数的影响，如何根据测定数据计算氧消耗速率和体积传质系数；（预习时填写）4、试分析实验过程中的主要误差来源，并提出今后实验改进的意见。

实验三微生物反应器的反应性能试验实验目的：进一步了解和掌握生物反应器BSTR和CSTR的反应性能，了解和掌握微生物菌体在反应器中生长的规律，并了解反应器的有关操作。

实验原理：间歇搅拌釜式反应器是一类常用的微生物反应器。

其主要特征是分批进料和卸料，因此其操作试剂由两部分组成：一是进行反应所需的时间，即开始进行反应直至达到所要求的反应程度为止所需的时间。

由于搅拌的作用，反应器内的物料充分混合，浓度均匀，反应器内物系的组成仅随反应时间而变。

对于菌体浓度而言，随着反应的进行，微生物菌体的浓度不断增加，其菌体浓度变化的规律基本上符合Monod方程。

连续搅拌釜式反应器也是一类微生物反应器，其反应性能和间歇反应器有明显的不同。

其主要特征是，反应物连续稳定地加入到反应器中，同时反应产物也连续稳定地流出反应器，并保持反应体积不变。

当反应器操作达到稳定时，反应器内物系的组成不随时间而变，同时由于反应器内的搅拌，使得物系在空间上达到充分混合，物系组成也不随空间位置而变，此时反应器内物系的组成和反应器出口的组成相同。

对应于一定的进料流量，反应器内的物系有一定的组成，对于菌体浓度而言，随着流量的增大，菌体浓度变小，当进料流量达到一定值时，反应器内的菌体浓度可以为零，这时称为反应器操作的洗出点。

设备和试剂1、微生物反应器2、可见分光光度计3、微型计量泵（蠕动泵）4、酒精酵母种子培养液5、葡萄糖实验步骤：1、反应培养基配制：培养基配方：葡萄糖20g/L、硫酸铵4 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钙0.2 g/L、酵母膏1 g/L2、反应器反应性能试验：A：间歇反应试验：加入一定体积的反应培养基，按10%的接种量加入酒精酵母种子液。

30℃，控制一定的搅拌转速和通气量进行反应。

每隔半小时，取一定量的反应液，测定其OD值。

B：连续反应试验：在间歇反应一定时间后，控制反应器内的反应体积在一较小值，在间歇反应条件下，用蠕动泵连续加入培养基，并控制出料阀门，使出料量等于进料量，以维持反应器内的液面位置不变，这时反应器在某一稀释率下进行连续反应。

当一定时间后连续反应达到稳定时，取样分析反应液的OD值。

调节进料流量和出料流量，使连续反应器在另一稀释率下反应。

流量的调节是从小到大，直至某一流量下反应器的操作达到洗出，完成试验。

分析方法：取5mL反应液，用水稀释50mL，用水作为对比，在可见分光光度计上在540nm 处测定其OD值。

数据记录：间歇实验结果记录表间歇实验结果记录表30min 40 min 30min 40 min 30min 40 min C glucoseOD数据处理：1、间歇反应菌体浓度随时间变化的曲线和连续反应菌体浓度随加料流量变化曲线，2、根据图中数据计算：μKs μ(1h)μ(3h)μ(6h)max分析和讨论：1、间歇培养过程中迟滞期的长短如何调整？如何判断连续培养中洗出点？（预习时填写）2、经实验数据可知，在连续培养过程中，什么情况下达到最佳稀释率？洗出点的稀释率为多少？实验四停留时间分布的测定实验目的：采用示踪法测定反应器的停留时间分布，了解发酵罐内流体的混合特性，有利于发酵罐的设计和操作。