2. 剪碎 用灭菌剪刀剪去鸡胚头部、腿部、翅膀和内 脏，留下躯干组织。用D-Hanks液冲洗，除去血液后 移入灭菌青瓶中，用灭菌剪刀尽量剪碎（1mm3小块）， 再用D-Hanks冲洗2次直至组织发白为止，然后将洗液 上清吸弃。 3.酶消化 根据鸡胚组织块的多少，加入大约4倍量的 胰酶(5-6mL)，于37℃温箱内消化15-20min，视其组 织碎块变松散（聚合成一团、边缘毛样模糊）即可。 轻轻吸出消化液，用D-Hank’s洗1-3次。

拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾 倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低 于瓶底；倾倒液体时两瓶口之间不能接触。

瓶内是严格无菌的，所以要保证吸管不接触到 瓶口的外壁。若一旦接触，更换新的吸管。
（2）倒置显微镜 （3）超净台
实验步骤
1.取胚 选择9-11日龄鸡胚
于蛋架上，先后用碘酒和
75%酒精消毒气室部外壳。 用无菌眼科镊子击破该部
位的蛋壳和卵膜，撕破尿
囊膜和羊膜，并轻轻夹住 鸡胚颈部取出鸡胚，放入 无菌平皿中。
1气室 2卵壳 3卵黄囊 4卵白 5 尿囊腔 6绒毛尿囊 7胚胎 8羊水腔 9胚胎外腔



用75％酒精擦拭消毒双手。 超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭擦净。 打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用 超净台时，打开风机，点燃酒精灯。




严格在酒精灯无菌范围之内操作。 使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端 安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水 瓶或试管内。 操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品， 如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。
4.吹打 加适量1640营养液，用巴氏吸管反复吹吸数次， 使细胞分散，制成细胞悬液。静置1分钟，使未冲散 的组织块沉淀，吸出细胞悬液于20mL 营养液中。重 复3次收集细胞悬液，直至鸡胚发白为止。 将纱布置于细胞瓶口，用吸管吸取细胞悬液滤过至细 胞瓶中（注意不要将悬液溢出）。 5.培养 于37℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成单层 细胞。
实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况；
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2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细 菌污染。
注意事项
1. 切割组织块时务必要切成小块 2. 整个操作过程要严格保持无菌
3.严格控制胰酶消化时间
4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期和
组别
5. 实验用品放回原处，摆放整齐
无菌操作的一般要求
第一讲 鸡胚成纤维单层细胞的制备 与培养
——预防兽医微生物组
实验目的
1.掌握无菌操作技术 2.掌握细胞培养所需的仪器、设备 3.了解细胞培养的相关理论
4.掌握鸡胚成纤维细胞的原代培养技术
实验背景
原代细胞培养因具有细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很 大变化，具备二倍体的遗传性、来源方便等优点而广泛应用 于病毒学、细胞分化、药物测试等试验。在禽类原代细胞培 养中，鸡胚成纤维细胞(chickenembryo fibroblast，CEF)得 到普遍应用。CEF的培养是在一定的条件下，在体外模拟体内 生理环境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传 代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。与其他细胞相 比，CEF相对容易获得，而且增殖能力强，适应性强，具有良 好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化，所以被广泛地 应用于分子和细胞生物学研究，以及疫苗的生产。
实验材料

预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液 (0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液)；D-Hanks
平衡盐溶液；

灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个； 巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪刀 1把； 碘酒，75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。

实验设备
（1） 37℃-CO2培养箱