细菌鉴定卡保存菌种[4]
本法适用于使用VITEK全自动微生鉴定仪的实验 室。方法是将鉴定卡标注后直接放置-20℃冰箱保 存，复苏时将鉴定卡直接从-20℃移至35℃，待小 孔液体完全融化后，以无菌手续，用注射器抽吸 出阳性生长孔内的液体，点种于合适平板，置 35℃孵箱内24～48小时即可。该法生化卡内的细 菌反复冻融 5次，分离出的细菌效果相同。葡萄 球菌属、肠杆菌属、念珠菌属存活时间不小于29 个月；肠球菌属、黄杆菌属、不动杆菌属存活时 间不小于21个月,链球菌属和假单胞菌属存活时间 不小于10个月。
菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离 心管。方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心 管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消 毒，放烤箱80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂 牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑 料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛 奶污染离心管口。③将加好菌液的离心管盒置20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻 干燥机干燥箱内冻干。④冻干后在净化工作台内 压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封 离心管口。放-20℃冰箱保存。
菌种的保存方法介绍
江西省临床检验中心 吴茂红
临床微生物实验室经常能够分离到一些有 意义的菌种，但接种在平板上的细菌放 4℃冰箱只能保存数天，并且细菌在培养基 上移种 3次后，其形态、菌落、毒力等均 易发生变异[1]，监测日常工作的室内质控用 标准菌株也需要长期留存。所以尽可能长 期有效地留存菌种对于系统地分析当前流 行株的生物学、分子生物学特征及耐药性 变迁，医院感染病原学调查、新药临床研 究都十分重要的意义。本文介绍几种常用 的菌种保存方法
低温冷冻保存法 实验室必须配备-20℃以下低温 冰箱，冰箱温度越低，保存的 时间越长。
滤纸片低温冷冻保存菌种方法[2]
将新华滤纸片剪成 3mm× 3mm，经高压蒸汽灭菌 置无菌器皿中备用，0.5ml无菌带盖塑料离心管。 将待保存菌种在血平板上分离纯化后，用无菌小镊 子夹住滤纸片，在平板上刮取多量细菌，放在塑料 离心管内， 1只离心管中可放数十片带菌滤纸片， 然后盖上盖子，用胶布将盖口封严，注明患者姓名， 菌名及保存日期等以备查找。将塑料管放在-70℃ 冰箱内保存。使用时将菌种分别从塑料离心管中取 出 1片，放入增菌肉汤中,35℃孵育18～24ｈ，再 将菌悬液移种于血平板上。本方法适于保存对营养 要求不高的细菌，而不适于苛养菌的保存。
⑵血液琼脂斜面保存法：链球菌及肺炎球 菌等对营养要求较高的细菌应接种于血液 琼脂斜面上， 37℃培养生长后，放 4℃冰 箱保存。链球菌须半个月至 1个月移种一 次，肺炎球菌则须 4d移种一次。 ⑶鸡蛋斜面保存法：将细菌接种于鸡蛋斜 面上，经 37℃18-24h培养后，加无菌液体 石蜡至斜面浸液，再超出约1cm，置 4℃冰 箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙门 氏菌及其它含表面抗原的细菌，可保存3-6 个月。
商品化菌种保存管
每只保藏管中含20-25个小珠以及缓冲液， 使用时将菌落挑入缓冲液中，混匀，将缓 冲液吸去，置-70℃冰箱保存可达10年，20℃冰箱可保存1-3年。复苏时，只需将小 珠接入肉汤或平板上滚动即可。商品化菌 种保存管操作简单，但价格偏高。笔者预 计随着经济的不断发展和实验室条件的改 善，使用的单位将会越来越多。
湿牛奶冷冻法[3]
材料 ①保护剂牛奶的准备：新鲜牛奶经脱脂棉 反复 3次过滤后，10磅10min高压蒸气灭菌后，冰 箱保存备用。②菌种管的处理：先经清洁液浸泡 1天，之后用清水冲洗，再用蒸馏水浸泡过夜，以 达中性，然后管口塞上棉花，经15磅30min高压蒸 气灭菌备用。方法 将各种细菌种于各自生长良 好的平板培养基上，经分纯后在37℃孵箱孵育18h 后，用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，然后用无 菌毛细滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部，每管球 部约有一半的菌液，之后火焰封口，保存于-20℃ 冰箱。抵抗强的细菌至少可保存 3年，抵抗力弱 的细菌保存不低于 2年。
⑷吕氏血清斜面：白喉棒状杆菌可保存在 该培养基上，其成份为 1 %葡萄糖肉汤 (pH7.4) 1份，无菌牛血清或兔血清 3份。 白喉棒状杆菌在此培养基上生长迅速、旺 盛，菌体形态典型，如在培养基中再加入 5%-10%的中性甘油，则培养出的白喉棒 状杆菌异染颗粒更为明显，单24小时后即 衰老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体 粗大3-4倍，置 4℃可保存 2周至 1个月。
斜面保存法
⑴普通琼脂斜面保存法：葡萄球菌、肠道 杆菌等对营养要求不高的一股细菌可接种 于普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无 糖肉膏液，以防干涸 (但变形杆菌"OX"及伤 寒杆"O"菌株宜接种于干燥的琼脂斜面以防 变异 )。用橡皮塞塞紧，经37℃18-24h培养 后，存放于 4℃冰箱中，一般可保存3-6个 月。
冷冻真空干燥保存法
该法是目前保存菌种的最佳方法，具有如下几个 突出的优点：①适用范围广。除少数不产生孢子 只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此方法保藏外， 其他各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝 状真菌及病毒均可采用此方法保藏；②保藏期长， 成活率高。有人报道保藏在真空冷冻干燥安培管 中的真菌成活期长达40多年[5]，一般微生物至少 可保存 10余年；③微生物在保藏期内可避免其它 杂菌污染；④便于携带运输，易实现商品化生产。 其缺点为需要一定的设备（冷冻真空干燥机）、 操作繁琐等。
砂土管保存法
适用于产芽孢的细菌
将过筛后的ห้องสมุดไป่ตู้性细砂烘干，装入小试管内 约lcm高，塞以棉塞，灭菌烘干备用。用无 菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物， 制成菌悬液。然后吸此菌悬液约0.5m1注入 砂土管内，以砂土全部浸湿为度。塞好棉 塞，放入干燥器内抽干。然后放在装有氯 化钙 (吸水剂 )的干燥瓶内，置冰箱保存备 用。需用时可取一接种环砂土接种于适宜 培养基上培养即可。
临床微生物实验室可以根据 本室的条件，挑选最适合的 菌种保存法，也可以加以改 良，其原则是除了菌种存活 外，还必须保证其生物学性 状不发生改变。
谢 谢!
常规保存法
该法操作简单，只需普通冰 箱保存，每个临床微生物实 验室均可采用。但缺点是留 存时间短，传代频繁，菌种 易变异。
半固体穿刺保存法
用穿刺接种法将细菌培养物接种于半固体培养基 内，经 37℃18-24h培养后，加一层无菌的液体石 蜡，厚度约为 1cm，置冰箱保存。肠道杆菌及葡 萄球菌等，一般可保存3-6个月。当需传代移种时， 将半固体菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再取 菌移种于新的培养基。将沾有少量液体石蜡的接 种环浸于 95％酒精中片刻，再烧灼灭菌以免直接 在酒精灯上烧灼时，液体石蜡四处溅散而引起污 染。如保存副溶血性弧菌可加入NaCl制成3.5%高 盐半固体，在室温下可保存 1个月。
该改良法优点有：⑴操作过程大大简化， 菌种管口不需溶封，不抽真空。⑵菌种管 抗破损性极佳；⑶菌种管体积超小。⑷成 本低廉，易于商品化生产、推广。笔者使 用该改良法近七年，本省发放菌种上万只 没有破损情况出现；数次发放嗜血杆菌、 链球菌、奈瑟氏菌等苛养菌，生长情况良 好。近几年我们还向华东地区部分兄弟省 分提供了室间质评菌种四万余只，效果满 意。