苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2ˊ,3ˊ ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4 组 独 立 的 DNA 合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4 种 不 同 的
ddNTP ，结果将生成 4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
第五章
核酸的序列测定
易发平
基础医学院生物化学与分子生物学教研室
DNA的测序是分子生物学研究中非常重要和关键的内
容。对DNA一级结构的研究，有助于探索基因结构与功
能、基因与疾病关系，进而推动生命科学研究获得质的
飞跃。测定基因组的全部核苷酸序列、阅读和分析全部
遗 传 信 息 ， 正 是 人 类 基 因 组 计 划 （ human genome project, HGP)的最主要目标之一。
2、大片段DNA序列测定的策略 （1）鸟枪法 将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定 的片段（300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶 I法和限制酶切割法。 （2）嵌套缺失法（nested deletion,Erase-a-base）
①首先将大片段克隆到测序载体；
②选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将
将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列碱基排
列顺序。
DNA 序列测定方法：


1. Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。
2.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应和C反
应。

3.自动测序法。
DNA 测序的主要方法有两种，即双脱氧链终止法（Sanger 法、酶促法）和化学裂解法（ Maxam-Gelbert 法）。二者 均依赖于高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 不管是酶促法还是化学法，都是分为4个反应体系进行测序
DNA切断,使切割后近载体端为3`突出的粘性末端，近待
测DNA的末端为5`突出的粘性末端或平端；
③用外切核酸酶 III 消化上述线性 DNA （ 37C ， 250 核苷酸 /min ），在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并 依次相差200-250bp的DNA片段。 ④用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经T4 DNA连
体，使测序引物便于结合模板DNA。
任何待测 DNA 序列的片段克隆于上述载体后，都
可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷
酸片段作为“通用引物”，该类引物可以与载体 DNA 序列互补结合，并以待测 DNA 为模板引导合 成新生链，用双脱氧终止法进行序列测定。
载体
DNA片段
酶切，连接
设计通用引物
主要是基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA为模板，根
据碱基配对的原则逐个将 dNTP 加到与模板结合的寡核苷
酸引物的 3′-OH 末端，形成正确的模板 DNA 互补链；②能 以 dNTP 作为底物，也能利用 ddNTP 作底物，将其掺入寡 核苷酸链的3 ′末端而终止新生互补链的延伸。
如果在DNA的合成反应中，除了加入 4种正常的脱氧核
在测序反应中通常设置 4 个反应，各反应管中同时加入一种
DNA模板和引物、DNA聚合酶I（失去5′
3′外切核酸酶活
性）、其中一管中分别加入一种 ddNTP （ 如ddTTP、dTTP） 以及其它三种dNTP（ dATP 、dCTP 、dGTP ），引物末端 用放射性核素标记， ddTTP的比例很小（1:10），因此掺入 的位点是随机的，经过适当的条件下温育，将会有不同长度 的 DNA 片段合成。它们都具有相同的 5′末端， 3′ 末端都因掺 入 了 ddTTP 而 以 T 结 尾 。 在 其 它 三 管 中 同 理 加 入 相 应 的 ddNTP。
反应，寡核苷酸链分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基。
4种反应体系的寡核苷酸链产物，进行变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳，放射自显影后，读出待测DNA的连续序列。
一、 Sanger 双脱氧链终止法
（一）原理(单链)
DNA链中的核苷酸是以 3`， 5`-磷酸二酯键相连接，合成
DNA所用的底物是2`-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger
接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆；
⑤将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相 同，测序结果可以从子片段序列的相互重叠部分准确无误地 将相邻片段的序列拼接起来。
目的片段
E B
E B
引物
BamH I
5` Exo III
3`
S1
T4 ligase
测序
引物
tttgggcccaaa atcggggctg……ggcatagt
ddCTP、 ddGTP ，则新生链的末端为 T、 C或G，根据 这个原理， Sanger 与 1977 年建立了双脱氧链终止测序法。 他本人也因此而获得了诺贝尔奖。
Sanger
双脱氧核苷三磷酸互补链来自成过程以单链或双链 DNA 为模板，采用 DNA 引物引导新生
DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。
双 脱 氧 链 终 止 法 中 被 掺 入 了 2` ， 3`- 双 脱 氧 核 苷 三 磷 酸
(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH，
不能再与其它的脱氧核苷酸形成 3′,5′-磷酸二酯键，DNA 合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个 ddATP ，则
新生链的末端就是 A ，依次类推可以通过掺入 ddTTP 、
Sanger 双脱氧测
序方法示
意图
双 脱 氧 法 测 序 原 理 示 意 图
（二）DNA序列测定的策略 1、测序载体和引物 双脱氧链终止法测定DNA序列时，通常是将待测片段先克 隆 到 M13 载 体 （ 如 M13mp18 和 M13mp19 ） 或 质 粒载 体 （如pUC18和pUC19）。克隆于M13载体，可获得单链模 板。克隆于pUC载体，则是直接采用双链DNA作为测序模 板，待测DNA克隆到质粒载体后，通过碱变性处理重组载
tttgggcccaaa ggcatagt……….cgatcag tttgggcccaaa cgatacgcg…..tcagtcgtag