转基因小鼠具体操作过程
• 构建载体，纯化 DNA片段，去除 原核载体序列 • 促排卵激素超排卵， 合笼，分离E0.5 受精卵 • DNA显微注射 • 胚胎培养过夜 • 胚胎回移代孕鼠 • 切尾鉴定 • 传代杂交 • 表达分析
转基因鼠建立时间表
注射 出生 分窝 传代
F1出生
分窝
分析
0
时间 （月）
1
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第一个转基因小鼠：1974年 第一个小鼠干细胞：1981年 第一个基因捕获小鼠：1989年 第一个基因敲除小鼠：1997年 第一个克隆动物：2008年 第一个CRISPR/CAS9小鼠
常见转基因技术
• 常规方法 ：受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入， 预见性低，但多样性 • 利用精子转染DNA，效率低，重复性差 • 利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受 限多 • 病毒感染：效率高，随机性低，可带DNA大小受限制， 安全隐患，常用于大动物 • 干细胞／胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预 见性高，费时，大动物不成功 • 核移植／动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径 • CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效 基因组修饰技术
Байду номын сангаас
转基因动物原理及应用
第一部分： 常规动物转基因技术原理 第二部分： 基因定位修饰技术原理 第三部分： CRISPR/Cas9技术原理与应用
第二部分：基因定位修饰
•基因定位修饰原理 •基因定位修饰过程 •基因定位修饰应用
基因定位修饰重要性
• 基因功能研究：随着基因组解析，基因敲除和 基因定位修饰进行基因功能解析 • 基因调节：可以人为控制基因位点准确修饰， 基因调节更为精确，研究结果更确定，病理模 型更有价值 • 基因修饰稳定性，低拷贝，对基因组影响小， 表达特定蛋白，大动物克隆，抗体基因组置换 • 基因治疗：准确定位修饰，结合人类干细胞培 养和CRISPR/Cas9技术，是将来基因治疗 (Gene Therapy)、组织再生(Regeneration Medicine) 重要途径
小鼠生物学基础及转基因优越性
•小鼠免疫力强，繁殖率高，体型小，为经济有效动物 模型 •小鼠遗传表型多样，全基因组序列解析，经典哺乳类 实验动物模型 •多种自交系 •孕期19－21天 •性成熟时间：母4－5周，雄5-6周 •母鼠发情周期5天左右 •成鼠体重：20-50克 •母鼠平均产子5－6窝，自交系每窝6-8只，远交系1014只
产生转基因鼠标准条件和要求
• 洁净动物房，高蛋白，高脂肪饲料（Breeder chows) • 供卵鼠：4-6周杂交子一代母鼠(C57B6xCBA or DBA),每次10-12只，每周两次 • 种鼠：年龄两月到一年的杂交子一代雄鼠 (C57B6xCBA or DBA) 20-24只 • 代孕母鼠：每次见栓2-5只，2-6月高繁殖率母 鼠(CD1)50-100只 • 结扎公鼠： (C57B6xCBA or DBA)子一代或 (CD1)雄鼠，各需求10-20只，适用年龄2-18月
什么是转基因？
• 狭义：人为将DNA片段插入基因组 • 广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随 机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定 位敲入，基因定点突变等
动物转基因的重要性
基础理论研究 （小鼠） • 研究基因调节，包括启动子功能 • 基因功能追踪（Knockout，Gene Trap） • 细胞追踪，如癌细胞转移（如EGFP基因敲入） • 基因表达与胚胎发育，器官发育 • 基因表达与生物学功能、病理发育 • 基因突变体表达功能研究 • 基因相互作用 应用研究 （大动物） • 生产活性蛋白：酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药（蛋白活性要求特异 的翻译后修饰） • 低生产成本：转基因动物可以传代，可以连续生产，如血浆蛋白，乳蛋白， 比细胞培养成本低 • 病理动物模型，利用动物模型研究疾病发生机理、药效测试 • 器官移植：解决器官不足，重复感染问题，如猪肝脏 • 品种改良(GMO)：抗病，高产，营养价值提升 • 疾病治疗：治疗遗传缺陷，组织再生
转基因技术研究历史
Rudolf Jaenisch in 1974. Jaenish successfully managed to insert foreign DNA into earlystage mouse embryo resulting mice carried modified gene in all their tissues and progeny. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from ealry mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci (USA). 1981;78:7634-8. Gossler, A., A. L. Joyner, et al. (1989). "Mouse embryonic stem cells and reporter constructs to detect developmentally regulated genes." Science 244(4903): 463-5. Hooper M, Hardy K, Handyside A, Hunter S, Monk M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 1987;326:292-5. Dolly (5 July 1996 – 14 February 2003) was a female domestic sheep, and the first mammal to be cloned from an adult somatic cell, using the process of nuclear transfer. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23. doi: 10.1126/science.1231143. Epub 2013 Jan 3.
其它转基因载体构件选取
• poly A ：提供稳定的mRNA • 常用poly A: SV40 poly A, -Globin poly A • 内含子选用：第一个内含子，如Globin 内含子 • 封闭区应用：增加表达几率，减少对 周围或被周围基因影响 • Loxp, FRT, tetO序列
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同时注射两个以上的转基因：效率高，一般插入同一位点 多拷贝插入方式：头尾相接 拷贝数与表达水平：无紧密关联，多数拷贝被甲基化，转录因子浓度限制 其它因素：DNA浓度(2-3ng/ul)，酒精、嗅化乙锭和EDTA残留 载体骨架DNA对转基因表达影响：原核序列不稳定 C57/BL6纯系转基因鼠受精卵注射：效率略低
• 拷贝数：Southern, Real time PCR • 插入位点：Inverse PCR • mRNA表达：
– In Situ – RT-PCR – Northern
• 蛋白表达：
– – – – – 显示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP, 荧光EGFP, RFP 功能分析： 结构变化：石蜡切片，H&E染色 免疫组织化学、免疫荧光定位：冰冻切片，抗体染色 免疫沉淀：Western
利用小鼠动物模型 研究基因表达与病理发育
郑耀武 转基因动物实验中心 综合实验楼205 zhengyw442@ 85098583
转基因动物技术原理与应用
第一部分： 常规转基因技术原理 第二部分： 基因定位修饰技术原理 第三部分： CRISPR/Cas9技术原理与应用
第一部分
常规转基因动物原理与应用
启动子的类型和选取
• 特异启动子：研究基因调节（lacZ），启动子功能， 调节其它基因表达。
– 用于其它基因表达，一定要查询启动子在转基因动物应 用文献，了解启动子完整性
• 高表达启动子选用：用于高表达某个基因，高表达 蛋白生产 • 广谱启动子应用：显示基因细胞标记（EGFP） • 可诱导启动子的应用：用于基因调节，有毒蛋白表 达，致命基因的调控 • 复合启动子：可诱导、高表达、组织专一基因调节 系统，用于调节基因或高表达蛋白
表达基因（cDNA）的类别
显示基因(reporters): lacZ, GFP, CAT, AP等 调节基因: Cre, ER-Cre, tTA, tTR,PTX等 蛋白质功能研究：蛋白突变体的表达 基因剪接：研究外显子、内含子功能 商业基因：药用蛋白，改良基因等 生理功能基因: 基因治疗，干细胞移植等 非编码基因：非编码RNA功能研究，siRNA 基因沉默, CRISPR/Cas9 gRNA基因组修饰 • 抗性基因：细胞筛选 • • • • • • •
真核基因结构与调节
• 真核基因结构（cis element)：启动子(promoter)， 外显子(exon)，内含子(intron)，polyA信号, 活化 信号（enhancers), 沉默信号（silencers），封闭 区(Insulators) • 转录因子(trans element)(transcription factors)， 活化因子(activators)，抑制因子(inhibitors) • 真核mRNA结构：Cap，5’非编码区(5’-UT)，编码 区(coding region)，3’非编码区(3’-UT)，polyA • 组织专一性调节(tissue-specific regulation, spatial) • 发育阶段调节(developmental regulation, timingly) • 诱导性调节(inducible) • 转录后调节: mRNA剪接和修饰， mRNA的稳定性， 蛋白质合成效率，蛋白质半衰期