板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。
实验操作步骤：
1）RNA提取：
关键 防止RNA降解
RNA 提取的成功与否 是RT-PCR 检测中最 重要的步骤。
2)逆转录： RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT; 特异引物)
5'
mRNA
cDNA
AAAAAAAA3' TTTTTTTT
思考题
? 结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源 基因转录表达的优缺点。
?RT-PCR—一步法和两步法
两步法：由于单管反应时 RT和PCR都不能在最 佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用 基因特异引物扩增较短的基因，及定量 PCR。两 步法则是将 RT和PCR分别进行，这样使得两个 反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨， 适合那些 GC含量、二级结构严重的模板或者是 未知模板，以及多个基因的 RT-PCR。
Transcripción reversa
GSP1 (sense) 1ra cadena cDNA
AAAAAAAAAA- 3' TTTTTTTTTT- 5'
GSP (antisense)
GSP1
PCR usando GSP+GSP1
GSP Requiere el conocimiento de la secuencia para dise?ar GSP and GSP1
【结果与分析】
? 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； ? 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的
电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果
实验中应注意的问题
? RNA提取过程中防止降解 ? 去除DNA的污染 ? 实验中注意设置阴性对照 ? 在冰上操作
A）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分
总RNA
2μL（1-5μg）
10×PCR buffer
1μL
dNTPmix（各2.5mM）
2μL
逆转录酶（200u/μL）
0.5μL
Oligo（dT） 或randorm 9 mers
2μL
ddH2O
至10μL
混匀后稍离心，42℃孵育30min，99℃ 5min然后4 ℃保温5min，终止反应后置冰
mRNA
cDNA
PCR 产物
?RT-PCR—一步法和两步法
?一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、 引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA 反转录与PCR 扩增。利用反转录酶和 Taq酶作用在同一体系中直接以 mRNA 为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使 mRNA 的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限 度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测 出总RNA中小于1ng 的低丰度mRNA 。与Taq 酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基 因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。
2、Northern blot (RNA)
3、real-time PCR ( RNA ）
反转录 PCR(RT-PCR)
Oligo dT, 逆转录酶 特异性引物, Taq酶
mRNA cDNA PCR
用途: 获得所需cDNA片段；检测基因表达
注意问题：
1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段位置 5、mRNA丰度
转基因植物表达的 RT-PCR 检测
实验原理
RNA 的多聚酶反应（ RT-PCR）是以mRNA 为 模板进行逆转录反应（ reverse transcription ， RT）与 PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中 少于10个拷贝的RNA 模板。
RNA 扩增包括两个步骤： ?在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成 RNA的互补cDNA ，加热后cDNA 与RNA 链解离， 然后与另一引物退火，并由 DNA 聚合酶催化引物 延伸生成双链靶 DNA ， 最后扩增靶 DNA.
0.5μL
dd water
补足至 20μL
（C）根据具体的条件设置PCR仪的循环程序：
（D）PCR结束后，取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳。
RT-PCR全过程
mRNA (sense)
AAAAAAAAAA- 3' Primer Antisense: TTTTTTTTTT- 5' oligo(dT)o
? 仪器
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微 量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电 泳系统，水漂，恒温水浴。
? 试剂
RNA 反转录酶，3U/μL Taq DNA 聚合酶，PCR缓冲液 （10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模
外源基因的转录表达
基因表达
? 基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA 和翻译成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
? 基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。
目前研究转基因植物外源基因 转录表达的常用方法
1、RT-PCR (RNA)
上。
3) PCR 特异性引物、模板、Taq 聚合酶。
（B）在0.2mL PCR 微量离心管中配制20μL反应体系
10×PCR buffer（含MgCl2） 3μL
2.5mmol/L dNTP
2μLBiblioteka 10μmol/L Primer1
1μL
10μmol/L primer2
1μL
模板CDNA
5μL
3U/μL Taq酶