液质联用分析方法开发及条件优化一、概述• LC-MS 的实验目的 •电离方式的选择 ESI 或APCI 正离子或负离子 •色谱柱因素直径和流速管路连接（Plumbing ） •流动相因素 pH 溶剂 其他•液质联用应用实例二、样品的预处理•认为LC/MS/MS 不需要样品预处理的理解是片面的 •LC/MS/MS 分析方法的现实情况•由于MS/MS 有很好的选择性, 用户很少能够“看到”基质 MS/MS 模式下，成百上千的基质谱峰是“看不见”的 •MS/MS 用户希望有最低的检测限, 因此他们可能会进更多的样品到LC/MS/MS 系统当中“看不见” 的基质谱峰会变得更加严重•许多后流出化合物并不是完全适合色谱分析，因此色谱柱当中会有残留物产生– 这些残留物会随着不断的进样而渐渐增多– 样品分析的越多，基质之间的互相干扰也越严重 •大量的基质会使离子源污染得更快并且损失灵敏度(一)、样品的预处理目的为什么需要液相分离串联质谱具有高选择性，为什么需要液相分离 –离子化过程中的基质效应基质物质与分析物共同流出喷雾针时，可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性，以及方法的重现性及线性–改善线性和准确性–提高灵敏度 –更好的专属性基质干扰：Loop 进样基质干扰 : 用色谱柱将基质和分析物分离二、样品的预处理•从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰 •从ESI 电离的过程分析ESI 电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能(一)样品的预处理目的（二）样品基质影响质谱检测器可耐受挥发性缓冲盐的使用然而…缓冲盐的类型和浓度干扰离子化过程（二）样品基质影响（三）样品的预处理常用方法•超滤•溶剂萃取／去盐 •固相萃取•灌注（Perfusion ）净化／去盐 •色谱分离反相色谱分离 亲和技术分离 •甲醇或乙腈沉淀蛋白 •酸水解，酶解 •衍生化三、LC-MS 分析条件的选择（一）、接口的选择•ESI 和APCI 在实际应用中表现出它们各自的优势和弱点•这使得ESI 和APCI 成为了两个相互补充的分析手段•概括地说，ESI 适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（蛋白质）•只要有相对强的极性，ESI 对小分子的分析常常可以得到满意的结果1、液质联用技术的相对适用范围2、接口的选择•APCI 不适合可带有多个电荷的大分子，它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析•ESI 对高分子量生物大分子和聚合物电离会生成多电荷离子，而APCI 在任何化合物电离中不能产生多电荷离子，并以（准）分子离子为主 •ESI 多适合反相液相色谱•APCI 要比ESI 更适合正相液相色谱（1）ESI 和APCI 的比较比较项目 ESIAPCI可分析样品 蛋白质、肽类、低聚核苷酸；儿茶酚胺、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等，可用热喷雾分析的化合物 非极性／中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯、脲等，可用热喷雾、粒子束技术分析的化合物 不能分析样品 极端非极性样品非挥发性样品，热稳定性差的样品基质和流动相的影响对样品的基质和流动相组成比APCI 更敏感；对挥发性很强的缓冲液也要求使用较低的浓度；出现Na +，K +．Cl -，CF 3COO -等离子的加成 对样品的基质和流动相组成的敏感程度比ESl 小；可以使用稍高浓度的挥发性强的缓冲液；有机溶剂的种类和溶剂分子的加成影响离子化效率和产物2、接口的选择（1） ESI 和APCI 的比较比较项目 ESIAPCI溶剂溶剂pH 对在溶剂中形成离子的分析物有重大的影响，溶剂pH 的调整会加强在溶液中非离于化分析物的离子化效率溶剂选择非常重要并影响离子化过程；溶剂pH 对离子化效率有一定的影响流动相流速 在低流速(<100µL)下工作良好；高流速下(>750µl)比APCI 差 在低流速（<100µl)下工作不好；在高流速下（>750µl ）好于ESI碎片的产生 CID 对大部分的极性和中等极性化合物可产生显著的碎片比ESI 更为有效并常有脱水峰出现 （2）ESI vs. APCI电离方式 流速(mL/mi n)样品类型 MW 范围ESI0.001-1.0 多电荷离子 MW >1000 Da<200,000 Da (M+H)+, (M-H)-及其碎片~̴103Da APCI0.2-2.0 (M+H)+, (M-H)-及其碎片<1000 Da（3）离子化模式的选择Yes化合物是否是极性的?化合物 热稳定吗?化合物是酸性、碱性还是中性?APCI 或 APPINoYesESI 中性 碱性酸性 ESI (正)ESI (负)APCINo（4）正、负离子模式的选择•一般的商品仪器中，ESI 和APCI 接口都有正负离子测定模式可供选择。

选择的一般性原则为： ●(1)正离子模式 适合于碱性样品可用乙酸(pH=3～4),甲酸(pH=2 ～ 3)或三氟乙酸对样品加以酸化。

如果样品的pK 值是已知的，则pH 要至少低于pKa 值2个单位•适合于碱性样品，肽和蛋白、弱极性化合物、环境污染物，例如农药和污染物、毒品、违禁物及其代谢产物有杂原子(N 2> O 2)可接受H +、Na +、NH 4+，如NH 2、N 、NH 、CO 、COOR样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式（4）正、负离子模式的选择●(2)负离子模式适合于酸性样品可用氢氧化铵、四乙基铵、四甲基铵以提高其pH值,对样品进行碱化。

pH要至少高于pKa值两个单位某些蛋白、寡核苷酸、有些糖( saccharides) 和多聚糖(polysaccharides)、某些药物的代谢物(例如葡糖苷酸共轭物(glucuronideconjugates)含强负电性基团物质有无杂原子(O2>> N2) 可失去质子? COOH、SH、NO2 ●3.可正可负:比较灵敏度●样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式●如果样品中含有较多的强负电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式（4）正、负离子模式的选择•有些酸碱性并不明确的化合物则要进行预试方可决定，此时也可优先选用APCI(+)进行测定 具体分析物的pKa值未知化合物时，可选用3个pH区域以正离子和负离子模式分别进行测试，然后选择一个APCI响应高的方法另外也可通过调节电晕放电电压和喷雾温度，使喷雾和电离优化，但在调节喷雾温度时要注意防止分析物的热解离（5）．分析物的衍生化•通过分析物的衍生化，使分析物更易离子化和/或具有高表面活性，对于中性有机分子如烯类、炔类、烷基卤代类、醇类、酚类、硫代类和氨类可以引入易带电类的功能基团，这些功能基团使分析物能通过加合和质子化进行电离；也可以通过引入电化学反应功能基团给这些中性分子使它们通过氧化还原进行电离•另外也可以通过给分析物引入非极性基团来提高分析物在ESI液滴的表面活性，如寡糖是一类高度亲水的物质而不太适合用常规ESI分析，但通过用三甲基-（对-氨苯基）铵(TMPA)衍生化使它带上了疏水性基团，提高了寡糖的质子亲和力和表面活性，其ESI响应提高了500倍以上，最大到5000倍（三）、大气压电离源的操作优化•得到相同的信号强度，绝对进样量和柱径的关系0.5 mm i.d.4 mm i.d. 2 mm i.d.1 mm i.d.4000 ng 1000 ng 250 ng 62 ng（1）、柱径因素1、HPLC柱的选择（三）、大气压电离源的操作优化(1)、柱径因素•Peak Height vs. Column DiameterCONDITIONS:250 pmol促肾上腺皮质激素(ACTH) on a μBondapak C18 column3.液相条件-色谱柱选择小内径柱改善测定灵敏度200ng联苯柱：Zorbax SB C18•通常来说低的色谱柱内径在相同流速下可以获得更窄的峰宽更高的灵敏度更短的分析时间，然而内径大的色谱柱可以提供高流速及大上样量的分析，分析寿命优于低内径色谱柱（2）.液相条件-选择相应的色谱柱用途 柱内径（ I.D.） 流速标准柱2-4mm 500-2500 μL/min Narrowbore 1-2mm 100-500 μL/min Micro LC 1mm 40 μL/min 800μm 20 μL/min Capillary LC 300 μm 4μL/min 180 μm 2 μL/min Nano LC100 μm 300nL/min 75 μm 180nL/min 50 μm80nL/min（3）.液相条件-色谱柱内径选择ESI流速: 1-1000μl/min内径1.0, 2.1, 3.0mm id 建议用2.1mm 内径 浓度相关 反相流动相APCI流速: 50-1500μl/min内径4.6, 3.0, 2.1mm id 建议用4.6mm 内径浓度不相关，进样多，信号强反相和正相流动相（4）.液相条件-色谱柱颗粒度选择5μm粒径扫描模式：wider peak width 简单样品3.5μm或更小的粒径 SIM, 增加灵敏度 增加分辨率 缩短分析时间 复杂样品等度组份5.液相条件-色谱柱长度选择短柱（15-75mm) •缩短时间•SIM ，Multiple ion mode •简单样品 •易区别分子量长柱（150 or 250mm) •提高分离效果•扫描模式 •Multiple –ion mode •复杂样品 •等度分离LC/MS 柱的选择<1000>1000Molecular WeightLow MediumHigh (or ionizable)ESIAPCIAPCIESIESISample PolarityIonization InterfaceLowHighLow HighRelative Sensitivity Low HighLowHighLow High4.6, 4, 32.1, 1Column Inner Diameter (mm)4.6, 4, 32.1, 12.1, 10.5, 0.320.18, 0.1, 0.0752.1, 10.18, 0.1, 0.0750.5, 0.322.1, 10.18, 0.1, 0.0750.5, 0.32Flow Rate (mL/min)2.0 - 0.20.2 - 0.052.0 - 0.20.2 - 0.050.2 - 0.050.02 - 0.0060.002 0 0.000040.2 - 0.050.02 - 0.0060.002 0 0.000040.2 - 0.050.02 - 0.0060.002 0 0.0000401123液质联用中色谱柱的选择•一般多采用反相柱(C8,C18…)•都是C18色谱柱,难道还有什么不一样吗？ •不同的品牌即是不同的色谱柱•选用能使用简单流动相的新型色谱柱(例如:Xterra, Xbridge, Acquity, Atlantis dC 18, Atlantis HILIC)XTerraMS 色谱柱的益处•色谱柱填料新技术(获2000年R&D100大奖) •突破传统填料技术的极限 高温稳定性宽pH 范围（1-12） 良好的色谱峰形 高速分析•对碱性化合物避免使用离子对试剂,简化流动相,有利于化解液质联用中LC 与MS 的矛盾 •Xterra 升级代色谱柱：XbridgeXTerra ™色谱柱之宽pH 范围 —简化方法开发过程(一以当三)低pH 硅胶柱高pH 聚合物柱中间pH 硅胶柱宽pH 范围的XTerra™杂化填料柱（三）、 大气压电离源的操作优化•流量的大小对LC-MS 成功的联机分析十分重要。