敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生 物素干扰）。
免疫组化及特殊染色
IHC方法
3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法： 使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍 ，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信 号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗 原。
免疫组化及特殊染色
IHC技术的基本操作流程
化 物
物 酶
酶
后
玻片干燥造成的“边缘效应”
免疫组化及特殊染色
石
冰
蜡
冻
切
切
片
片
假阴性：注意内对照
酒
福
精
尔
固
马
定
林
固
定
结肠，CEA 气 泡 影 响 抗 体 抗 体 反 应
胰腺，in
免疫组化及特殊染色 平滑肌肉瘤，SMA
假
蛋
阴
白 酶
性
未 处
理
蛋 白 酶 处 理 后
皮肤，IV胶原
微
微
波
波
未
处
处
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
DAB显色，蒸馏水中止反应
苏木素复染及封片
免疫组化及特殊染色
切片
烤片
脱蜡水化
H2O2处理
热修复
二抗 Enlivision试剂
DAB显色免疫组化及特殊染色
一抗 苏木素复染
IHC染色结果的判读原则
免疫组化及特殊染色
I. 注意影响IHC结果判读的因素
未
阻
阻
止
止
内
内
源
假
源 性
性 过
阳
过 氧
氧 化
性
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
一抗孵育，TBS漂洗
二抗孵育，TBS漂洗
同种异体抗原 动物免疫血清
免疫组化及特殊染色
抗体（antibody）指机体的免疫系统在 抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应 抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
免疫组化及特殊染色
世界著名抗体公司
Santa公司、Abcam公司、 Abgent公司、Proteintech Group、
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
免疫组化及特殊染色
荧光素、酶
标 记
抗体
组织抗原 抗体 酶 荧光素
抗原
荧 光
阳性色彩
显微镜观察
免疫组化及特殊染色
三大系统 本技术是应用免疫学原理 来识别待测抗原，再通过酶和底物 的作用外加显色剂，将上述反应显 示出来。
免疫组化及特殊染色
免疫组 织化学
识别系统 联结系统
显示系统
免疫组化及特殊染色
识别系统是指特异性抗体识别组织 或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特 异性结合是本技术的基本依据。
免疫组化及特殊染色
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
理
理
后
甲状旁腺，PTH
免疫组化及特殊染色
II. 染色的特异性判定
免疫组化及特殊染色
免疫组化及特殊染色
免疫组化及特殊染色
IHC方法
1 过去用过的方法——ABC法，SP法。——三步 法，使用生物素
2 目前最常用的方法——二步法： EnliVision 显色系统（即用型非生物素免疫组化 EnliVisionTM plus检测试剂盒 ）
将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧 化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大 分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50 倍。
免疫组化及特殊染色
联结系统由联结抗体构成。它的作 用是联接识别系统和显示系统。
免疫组化及特殊染色
显示系统的目的是使抗原抗体间的 特异性结合变为肉眼可见。因此显 示系统由标记酶，底物和显色剂组 成，以在靶抗原存在位点上形成有 色沉淀。
免疫组化及特殊染色
特点： 特异性强 灵敏度高 定位准确和简便快速等优点 又能够将形态、功能及代谢的研 究有机结合起来。
免疫组织化学技术 Immunohistochemistry
techniques
免疫组化及特殊染色
第一节 免疫组织化学 技术概述
免疫组化及特殊染色
（一）发展简史
1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁 蛋白标记Ab技术
Cell Signaling Technology（CST）、 罗氏公司（Roche）
免疫组化及特殊染色
标记物
它借助于荧光素、酶等标记抗体 与组织切片或细胞涂片中相关抗原相 结合，由于荧光素所发荧光可用荧光 显微镜检出，而酶可经一定的显色处 理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准 确定位欲测定的抗原物质。
免疫组化及特殊染色
（二）免疫组织化学的原理
定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体 特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光 素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多 肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技 术(immunocytochemistry)。