一、包装细胞293T 细胞的培养一、293T 细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T 细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为 3 X10 5个/ml。

4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。

三、293T 细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。

5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下只供学习与交流5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe) 2. TaqMan Un iversal PCR Master Mix (Applied Biosystems 4304437) 3. TaqMan DNA Template Reage nt Kit (Applied Biosystems 401970)4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems 用于包装的293T 细胞的培养用于包装的293T 细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。

任何时候细胞汇合率都不准达 到 100%。

慢病毒的包装1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是 8 X 10 6个。

3. 第二天，镜下检查细胞。

细胞融合度应大致为30-40% ，分布均匀。

4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G 质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml 。

另一支中加入 500卩l Trans -EZ 溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀。

将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

cat. no.cat. no. cat. no. 4316844)in 帕*;Tri £luctionSunBio IV VectorPackaging Cell关键步骤：推荐使用 Qiagen 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育20分钟，使DNA 和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。

7. 取1支5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml 。

来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。

每一皿细胞培养 盘不要超过6盘。

8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的DMEM 完全培养基。

9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80% 。

如果所转染质粒带有 GFP 荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养 2天（36-48小时）。

在这个过程中，细胞会逐渐融合 形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。

12.4 C, 500g 离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13.总的上清约为204 ml ，用250- ml 0.45 卩m PVD 过滤装置过滤。

如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

慢病毒的浓缩与纯化 方法一超速离心沉淀法 1. 取 6 个 Ultra-clear SW28 外灯继续消毒30分钟。

2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。

离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫[IN A W .WTfflMfZ C JJ TO 祝3. 取一支10ml 的移液管，吸取12 ml 20% 的蔗糖溶液。

将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 。

同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。

另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理。

4. 用PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g 。

5. 按次序将所有6 个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。

7. 小心将管子从转头中取出。

倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10 分钟使剩余的上清流干。

吸掉剩余的液滴。

在管底应当有可见的沉淀。

8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS 洗下沉淀。

9. 将SW28 超速离心管插入到50ml 锥底离心管中，盖上盖子。

10. 在4 C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11.4 C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。

12. 用200卩I移液器轻柔吹打使沉淀重悬。

避免产生泡沫。

将所有管中的液体集中到一个SW28 离心管中。

13. 集中后的病毒悬液分装成50卩I每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80 C 。

方法二PEG-8000 浓缩法PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀浓缩的目的。

5X PEG8000+NaCI 配制称取NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200mI MiIIi-Q 纯水中；121 摄氏度30min 湿热灭绝30min ；保存在 4 C 。

1. 使用0.45 ym滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20〜30min 混合一次，共进行3-5次；4. 4 度放置过夜；5. 4 度, 4000 g ,离心20min ；6. 吸弃上清,静置管子1 〜2 分钟,吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50卩每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80 C病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。

”TU”为” transducing units ”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1X 105/ml ,加入96孔板，100卩1/孔,为每个病毒准备10个孔。

放入37 C, 5%CO 2培养箱中培养。

第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。

稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5ml EP 管，每管加入90卩1培养液，往第一个管中加入10卩1病毒原液，混匀后，吸取10^1加入第二个管混匀。

依此类推，做十个稀释度（10~10 -8）。

吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。

并做好标记。

第三天追加培养液在每个孔再加入100卩1完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。

假设为X 和Y，则滴度（TU/ml ）= （X+Y*10 ）*1000/2/X 孔的病毒液的含量（卩）。

定量PCR 法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。

每孔细胞为5X 10 4个。

接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N 。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5卩g/ml polybrene 的新鲜培养基。

将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1卩1病毒加入到199卩1的培养基中。

在3个培养孔中分别加入0.5卩1, 5^1和50 ^1的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为500^1含DNasel （Takara Mirus Bio ，终浓度为10 U/ml）的新鲜培养基。

在37 C 消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA 。

然后换为2ml 正常的培养基，继续培养48 小时。

用0.5ml 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37 C放置1分钟。

用培养基吹洗下，离心收集细胞。

按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。

每个样品管中加入200 ^1 洗脱液洗下DNA。

用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad )。

基因组DNA可以稳定保存在-20 C至少2个月。

准备PCR所需的试剂和样品。

为病毒序列检测引物配总管I :n = number of reactions. 例如：总反应数为40 ,将1ml 2 X TaqMan UniversalPCR Master Mix , 4 卩l forward primer , 4 卩l reverse primer , 4 卩l probe 和788 卩l H2O混和。

震荡后放在冰上。

为人基因组序列检测引物配总管n :n = number of reactions. 例如：总反应数为40 ,将1ml 2 X TaqMan UniversalPCR Master Mix , 100 卩l 10 X RNaseP primer/probe mix 和700 卩l H2O 混和。