中国生物制品学杂志2013年9月第26卷第9期Chin J Biologicals September 2013，Vol.26No.9手足口病（hand -foot -mouth disease ，HFMD ）是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症。
可引起HFMD 的肠道病毒有20多种（型），其中以柯萨奇病毒A16型（Coxsackie A16virus ，CoxA16）和肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）最为常见，而发病死亡的患儿主要是因为感染了EV71［1-3］。
目前，尚无公认的可用于人的有效疫苗可供使用［4］。
因此，该疫苗的研制十分紧迫。
本实验对EV71疫苗制备过程中病毒收获液的蛋白成分进行初步分析，以期为该类疫苗的研发及质控提供参考。
肠道病毒７１型收获液蛋白成分的分析高嵩，李爱灵，黄浩，赵玉秀，苏桂民，王辉北京天坛生物制品股份有限公司，北京100024摘要：目的分析肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）收获液中的蛋白成分，为该类疫苗的研发及质控提供参考。
方法将EV71安徽阜阳株接种于Vero 细胞，病毒培养72h 后，收获病毒液，经蔗糖密度梯度超滤离心、甲醛灭活、DEAE Sephorase FF 介质离子交换层析纯化，获得纯化样品。
应用透射电镜分析样品中病毒颗粒的形态；对非还原型SDS -PAGE 检测疑似病毒衣壳抗原蛋白VP1和VP3条带进行N -末端氨基酸序列分析；液相色谱（liquid chromatogra －phy ，LC ）与电喷雾电离质谱（electrospray ionization ，ESI -MS ）结合的方法分析样品中所含的蛋白成分。
结果纯化的EV71样品在透射电镜下可观察到20～30nm 的球形EV71颗粒，呈典型的肠道病毒形态；经SDS -PAGE 分析，第2和第3条带所在位置与文献报道的EV71衣壳蛋白VP1和VP3大小相符，N -末端氨基酸序列与GenBank 报道的安徽阜阳株序列（ACD63039.1）一致；LC ／ESI -MS 质谱分析显示，纯化EV71样品中病毒蛋白成分占绝对优势，包括EV71的蛋白多聚体、VP1、VP2、VP3、VP4蛋白。
结论对EV71疫苗制备过程中病毒收获液的蛋白成分进行了初步分析，为该类疫苗的研发及质控提供了参考。
关键词：肠道病毒71型；纯化；蛋白成分中图分类号：R373.2+3R392-33文献标识码：A 文章编号：1004-5503（2013）09-1201-05Analysis of protein component of harvested liquid of enterovirus 71GAO Song,LI Ai -ling,HUANG Hao,ZHAO Yu -xiu,SU Gui -min,WANG HuiBeijing Tiantan Biological Products Co.Ltd,Beijing 100024,China Corresponding author:WANG Hui,E -mail:wh6247@Abstract ：Objective To analyze the protein component in harvested liquid of enterovirus 71（EV71）and provide a ref －erence for development and quality control of EV71vaccine.MethodsEV71Anhui Fuyang strain was inoculated toVero cells and cultured for 72h,and the harvested liquid was concentrated by sucrose density gradient centrifugation combined with ultrafiltration,inactivated with formaldehyde and purified by DEAE Sepharose FF ion exchange chromatog －raphy.The morphology of virus particles in test samples was analyzed by transmission electron microscopy,while the amino acids at N -terminus of suspected virus capsid protein VP1and VP3bands determined by non -reduced SDS -PAGE were sequenced ，and the protein component by liquid chromatography （LC ）and electrospray ionization （ESI -MS ）.Re －sults Spheroidal particles at sizes of 20~30nm were observed in purified EV71samples under transmission electron microscope,which showed typical morphology of enterovirus.SDS -PAGE showed that the locations of the 2nd and 3rd bands were consistent with those of VP1and VP3of EV71reported respectively.The amino acid sequences at N -terminus of the two bands were consistent with that of EV71Anhui Fuyang strain reported in GenBank （ACD63039.1）.LC ／ESI -MS showed that viral protein components were prominent in purified EV71,including polymer,VP1,VP2,VP3and VP4.Conclusion The protein component of virus liquid during preparation of EV71vaccine were preliminarily analyzed,which provided a reference for development and quality control of the vaccine.Key words ：Enterovirus 71（EV71）；Purification ；Protein component·疫苗研究·通讯作者：王辉，E -mail ：wh6247@1201··DOI:10.13200/ki.cjb.0001401材料与方法1.1毒株及细胞EV71安徽阜阳株（AHYF087-P5V3工作毒种）由北京生物制品研究所有限责任公司李秀玲研究室提供；Vero细胞（129代，第2007-0117批工作代）由天坛生物制品股份有限公司疫苗四室提供。
1.2主要试剂199培养基由北京天坛生物制品股份有限公司培养基室提供；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司；DMEM培养基购自美国SAFC公司；测序级胰蛋白酶购自瑞士Roche公司；丙酮购自北京北化精细化学品有限公司；DTT购自北京化学试剂公司；SDS、HCl、APS、TEMED、丙烯酰胺、三叉丙烯酰胺、Trish和溴酚蓝购自北京化工厂；DEAE Sephorase FF介质购自美国GE公司。
1.3细胞培养及病毒接种复苏冻存的129代Vero细胞，用含10%小牛血清的199培养基培养细胞，按1∶6的比例传代扩增。
待细胞传至133代时，按MOI0.014接种EV71，于33℃培养病毒。
病毒接种20h后，用0.013mol／L的PBS（pH7.4）洗涤3次，加入含0.1%人血白蛋白的DMEM维持液（pH7.4）维持培养。
病毒培养至72h后，收获病毒。
1.4病毒的浓缩、灭活及纯化收获的病毒液经28000r／min蔗糖密度梯度超滤离心16h，1∶4000甲醛25℃灭活7d后，经DEAE Sephorase FF介质进行离子交换层析纯化。
1.5纯化ＥＶ７１样品的鉴定1.5.1电镜分析将纯化EV71样品送中国农业科学院原子能研究所进行透射电镜扫描分析。
1.5.2SDS-PAGE及VP1和VP3N-末端氨基酸测序分析纯化的EV71样品经12%非还原型SDS-PAGE分析后，对与文献报道相符的疑似病毒衣壳抗原蛋白VP1和VP3条带进行N-末端氨基酸序列分析［5］。
1.5.3LC／ESI-MS质谱分析纯化EV71样品送北京蛋白质组研究中心，采用液相色谱（liquid chro-matography，LC）与电喷雾电离质谱（electrospray io-nization，ESI-MS）结合的方法，应用ESI-FTICR液质联用仪对样品中所含蛋白组分进行初步鉴定，设置条件为：检索NCBI-2009数据库、胰蛋白酶酶解方式、最大允许肽质量误差±0.5Da；每个肽只允许有1个不完全裂解位点；可能的修饰方式Carbami-domethyl（C）和Oxidation（M）。
2结果2.1纯化ＥＶ７１样品的电镜分析结果纯化的EV71样品在透射电镜下可观察到20～30nm的球形EV71颗粒，呈典型的肠道病毒形态，见图1。
A：200nm；B：500nm。
图1纯化EV71样品的透射电镜扫描图（×80000）Fig1.Transmission electron microscopy of purified EV71（×80000）2.2纯化ＥＶ７１样品的ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及ＶＰ１和ＶＰ３Ｎ-末端氨基酸测序结果纯化EV71样品经12% SDS-PAGE分析，第2和第3条带所在位置与文献报道的EV71衣壳蛋白VP1和VP3大小相符，见图2。
测序结果显示，条带2的N-末端氨基酸序列为Gly Asp Arg Val Ala，条带3的N-末端氨基酸序列为Gly Phe Pro Ala Glu，与GenBank报道的安徽阜阳株序列（ACD63039.1）一致，条带1为VP2和VP4的组合（前体蛋白VP0）。