第二章植物组织培养的基本理论、条件与操作技术第一节植物组织培养的基本理论一、植物细胞的全能性及其表达1. 植物组织培养（Plant tissue culture）：在离体条件下，利用人工培养基对植物器官、组织、细胞和原生质体等进行培养，使其生长成完整植株的过程。

外植体（explant)：由活体（in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。

分类：广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（organ culture）、茎尖分生组织培养(shoot tip culture, shoot apex culture, apical meristem culture)、愈伤组织培养(calluse cultrue)、细胞培养(cell culture)、原生质体培养 (protoplast culture)2. 植物细胞的全能性（totipotency）：一个具有完整细胞核的植物细胞，拥有该植物的全部遗传信息，在适宜条件下进行表达，具有分化发育成完整植株的潜能，称为~。

植物组培诞生的理论基础。

不同类型细胞全能性的强弱：卵细胞＞茎尖、根尖分生组织＞形成层＞薄壁细胞＞厚壁细胞（木质化）＞特化细胞（筛管等细胞）。

3. 植物细胞全能性的表达全能性的表达：从离体培养的植物细胞或组织诱导分化成完整植株的过程称为~。

全能性只是一种可能性。

完整细胞核具有该植物体全套的遗传信息，是全能性表达的内因。

全能性表达须满足2个条件：1）脱离整株，切断胞间连丝，解除抑制；2）营养和激素，使其脱分化与再分化。

二、植物细胞的脱分化与再分化1. 细胞分化（Cell differentiation）定义：指在个体发育中，由同一种细胞类群经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同细胞类群的过程。

细胞分化是组织与器官分化的基础。

细胞分化的本质是基因差别表达。

通过组培研究，揭示细胞的分化规律：1）成熟细胞未表达基因并非永久关闭，条件适宜即表达。

2）生理生化分化先于形态结构分化。

3）完整植株中，细胞发育途径一旦被决定常不再改变，而离体培养可通过脱分化消除这种决定。

4）极性是植物细胞分化的基本现象，即在器官、组织、细胞中，在不同轴向上存在生理生化和形态结构的梯度差异。

5）由不等分裂导致细胞分化的差异，说明细胞质在起作用。

6）有位置效应，可能与生理状态和激素分布有关，导致基因表达差异。

7）植物生长调节剂对细胞分化有关键调节作用。

8）细胞分化时，常见核内多倍性和多线染色体。

2.脱分化（dedifferentiation）:在组培过程中，已分化的成熟细胞失去原来的结构和功能，恢复为分生状态，经分裂形成愈伤，或只形成未分化细胞特性的过程为~。

分化的逆转。

影响脱分化的因素：1) 脱离母体：损伤是前提，自我调节和修复。

2)生长调节剂：生长素起主要作用。

3) 外植体生理状态：对培养的反应不同，如花器官较易，茎叶较难；幼嫩组织较易，老熟组织较难。

4) 基因型：双子叶易于单子叶，同种植物有差异。

3. 愈伤组织（callus）:在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

4. 再分化/再生 (redifferentiation/regeneration): 由脱分化的愈伤组织或细胞在一定培养条件下重新分化，形成各种组织、器官甚至完整植株的过程。

植物离体再生的途径：1）器官形成 (organogenesis)：从愈伤组织或外植体形成不定芽、不定根，然后形成完整植株。

2）体细胞胚胎发生 (somatic embryogenesis)：从体细胞诱导的愈伤组织形成类似于合子胚的结构（体细胞胚），进一步发育成完整植株。

也可直接由外植体再生体细胞胚。

组织培养的过程：第二节植物组织培养的基本条件一、实验室及其设备1. 准备室主要设备：电冰箱、天平、酸度计、高压灭菌锅、烘箱等。

2. 接种室（无菌操作室）主要设备：超净工作台。

3. 培养室主要设备：培养架、控光温设备、摇床、培养箱。

4. 细胞学实验室主要设备：显微镜。

主要以1——3为主。

二、培养条件1.温度：一般25± 2℃，过高过低抑制生长和分化。

2. 光照：每日光照12~16 h，光强1000~5000 lx。

3. 湿度：室内相对湿度70%～80%, 过低使培养基失分，过高易造成污染。

4. 氧气：封口膜、棉塞、纱布+牛皮纸。

第三节培养基及其配制一、培养基的成分培养基=水+无机＋有机＋激素＋固化剂＋其它1. 水：蒸馏水、自来水（大规模生产）。

2. 无机盐1）大量元素：浓度大于0.5mM或100mg/L。

N：KNO3、NH4NO3，有时添加氨基酸；P：KH 2P04 ；K： KN03 ；Ca: CaCl2 ∙2H2O;Mg, S: MgSO4∙7H202）微量元素：浓度低于0.5 mM 或 100 mg/L, 一般10-7~10-5M，缺少会导致生长、发育异常。

Cu：CuSO4 ;Fe: FeSO4∙7H20 与 Na2EDTA ∙2H20的螯合物；B: H3BO3 ;Mn: MnSO4 ∙H20 ；Mo: Na2MoO4Co: CoCl2 ∙6H20Zn: ZnSO4 ∙7H203. 有机化合物1）糖：常用蔗糖（2%~5%），葡萄糖和果糖等也用，大规模生产用绵白糖/砂糖。

最常用的碳源（Carbon source）是蔗糖（sucrose），葡萄糖和果糖（Glucose and Fructose）也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。

麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖（Maltose, galactose, mannose and lactose）在组织培养中也有应用。

蔗糖使用浓度在2%—5%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%­15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。

2）维生素：用量一般 0.1~1.0 mg/L。

常用：VBl (盐酸硫胺素) ：促进愈伤组织的产生和生长；VB6 (盐酸吡哆醇) ：促进根的生长；VB3 (烟酸) ：与代谢和胚的发育有关；Vc ：抗氧化，防止组织褐变。

也用VH (生物素) 、叶酸和VB12 。

3）肌醇：促进组织生长及胚状体、芽和细胞壁的形成。

用量一般 50~100 mg／L。

4）氨基酸及有机添加物：常用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；也用水解酪蛋白 (CH，aa混合物 ) 。

用量10~1000mg／L。

营养丰富，易引起污染，一般不用。

5）天然复合物：椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥、马铃薯泥等，含aa、激素、酶等化合物，促进细胞增殖与分化，但成分复杂，一般不用。

4. 植物生长调节物（plant growth regulator）植物激素：是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。

植物激素包括：生长素，细胞分裂素，赤霉素，乙烯，脱落酸等，1）生长素类 (auxin)：用量0.01~10 mg/L。

在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。

在促进生长方面，根对生长素最敏感。

在极低的浓度下，(105--10-8mg／L)就可促进生长，其次是茎和芽。

2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）:起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。

适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。

2,4,5-T（三氯苯氧乙酸）；NAA（naphthalene acetic acid，萘乙酸）:在组织培养中的起动能力要比IAA高出34倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。

IAA（indo acetic acid，吲哚乙酸）:是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。

IBA（indole butyri acid，吲哚丁酸）:促进发根能力较强的生长调节物质作用强弱：2,4-D＞ NAA＞IBA＞ IAA。

2,4-D 常用于愈伤的诱导，NAA常用于生根。

2）细胞分裂素类 ( cytokinin )：用量 0.1~10 mg/L。

6-BA/BA（6-苄基氨基/腺嘌呤）；BAP (卞氨基嘌呤)；KT（kinetin，激动素）；Zt（zeatin，玉米素）2-ip（异戊烯基腺嘌呤）等。

作用强弱：Zt＞2-ip＞6-BA/BAP＞KT。

6-BA 和 KT 常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖。

在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。

②促进细胞分裂与扩大。

③抑制根的分化。

6-BA 和 KT 常用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低。

3) 赤霉素（Gibberellins, GA’s）有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同。

培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。

4）脱落酸（Abscisic Acid, ABA）促进叶片离体（脱落）和种子休眠在水分胁迫下气孔关闭过程中起主要作用在干旱时促进胚胎形成，确保形成正常的胚胎。

赤霉素和ABA 都可以促进体胚发生。

激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。

如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。

高：有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素。

适中：有利于根芽的分化。

低：有利于芽的形成。

5. 固化剂1）琼脂(agar)：用量 6~10g／L。

2）其他：滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。

除上述5类外，特殊情况下加抗生素、活性炭。

二、培养基的pH值范围 5.5~6.0，一般 5.8。

pH 值高于6.5时，培养基常变硬；低于5.0时，琼脂不能很好凝固。

高压灭菌会降低pH值约0.2~0.3。

pH值用0.1M的NaOH和HCl来调整。

三、培养基的渗透压培养基中的盐类、蔗糖等影响渗透压，通常1~2个大气压即可。

实际考虑不多。

培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。

通常1—2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5—6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。