分析方法验证——专属性
定义：指一种方法在有可能的干扰物质（如杂质、降解产物和基质）存在时， 能够准确无误地评估被分析物的能力
鉴别:确保可以鉴别被分析物 纯度检查：确保所有的分析过程能够为杂质的含量提供准确的数据，如相关
物质检查、重金属限度检查、有机挥发性杂质检查等 含量测定：提供准确的检测结果以保证含量样品中被分析物的含量或效价值
分析方法验证——验证项目
验证项目 USP
I类
准确度
+
精密度
+
专属性
+
检测限
-
定量限
-
线性
+
范围
+
-不强制要求
II类
定量
限度检查
III类
IV类
+
*
*
-
+
-
+
-
+
+
*
+
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+
-
*
-
+
*
*
-
+必须进行 * 根据不同的方法特点也可能需要
❖I类方法：制剂中原料药或活性成分（包括防腐剂）的定量分析方法； ❖II类方法：原料药中杂质或制剂中降解化合物的分析方法；包括定量方法和限度检查； ❖III类方法：药物性能特征分析方法：溶出，药物释放 ❖IV类方法防止生物制品降解，但同时使分子的 某些部分难以被检测到
被结构所保护的易受影响基团延缓了降解过程（氧 化、脱酰胺基、切断和聚合）
完整结构使得分析方法很难检测到内部的变化
在某些分析中保持三维结构是很重要的（如SEC）， 但在其他一些分析中则需拆开折叠结构（如变性凝 胶电泳）
方法 100％浓度≥6次 3浓度×3次
分析方法验证——准确度
定义：方法的检测结果与真实值的接近程度。 －方法：
原料药：分析已知含量的对照品；第二种确定的方法分析，结果比较 制剂：加样回收；第二种确定的方法分析，结果比较 应在方法的范围内 计算回收率：3浓度×3次
的成立基础。
若一应采般进用认一与为步产该验品方证相法被似的检工特测艺异物进中性行其较处它好理物。后质为再能表免否明
一般采用相似物、不含API空白样品 疫细引动起胞非物测特，定异则方性所法免获的疫得特反抗异应体性。的，特可异进性行更相好关。试
作为阴性对照，以标准品或经认可样 另验外进，行产验品证中，存如在加的入大抗量体目或的特蛋异白抑可制能剂
分析方法验证——验证项目
参数（parameler) 专属性/特异性（specificity）
选择性（selectivity） 精密度（precision） 重复性（repeatability） 中间精密度（intermediate precision） 重现性（reproducibility） 准确度（accuracy）
资料6.质量研究资料，临床前有效性及安全性研究资料 （1）质量研究及注册标准研究资料； （2）检定方法的研究以及验证资料； （3）与同类制品比较研究资料； （4）产品抗原性、免疫原性和动物试验保护性的分析资料； （5）动物过敏试验研究资料； （6）动物安全性评价资料。
分析方法验证——法规要求
1.6探索性研究及其检验结果分析 1.6.1开展探索性研究项目及其目的。叙述开展探索性研究的项目，研究目的，采用 的主要方法。 1.6.2探索性研究及其检验结果分析。逐项叙述探索性研究项目详细研究方法，样品 与对照品的典型图谱或照片，研究结果与结论。 该项目的方法学按中国药典附录验证，详细方法学验证内容在附件中列出。
线性（linearity） 范围（range）
检测限（detection limit） 定量限（quantitation limit）
耐用性（robustness）
机构（organization） USP,EP,ChP,ICH ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH
ICH,ChP,ISO 17025 ICH,ChP
作类为方重法要，参并考需进。行此全类面方的法验在证被确。定应为说标明准参方考法文前献已的经出过处了，适附当原的文 验及译证文。。申报者应说明方法的来源，并附具体方法。研制单位在首 自己次建采立用的此方类法方法前，也应对该方法进行适当的验证，如进行专属 性对和于精某些密产度品的验，尤证其，是以创便新证性明产在品实来际讲的，使由用于条缺件少下可该参方考法的也方是法适， 用通的常。需要自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进行全面 标准而方严法格的的替验代证方。法 此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申报 者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新方法 等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两种方法 的比较性资料。
健康元生物医药有限公司
药品分析方法建立及验证
——从质量控制出发
2016.03.23
目录
•方法开发考虑 •方法哪里来 •开发什么方法 •检测方法初识 •分析方法验证 •分析方法确认及再验证
方法考虑原则
预期的监督机构期望 产品质量参数对安全性和有效性的预期影响 分子的具体开发经验 来自之前以开发的类似分子的平台经验
对于所要分析的蛋白质物种，通常无法获得纯的样品 用来进行加样/回收的物质是所要分析的蛋白质物种
（杂质）的富集物，而不是纯化物
方法开发考虑
基质（配方组成）或酸碱度变化、自由巯基的出现等， 可能在分析过程中形成原来并不存在的杂质
通过溶液交换消除基质影响
减少暴露于过高或过低酸碱度溶液的时间
在某些特定方法中，自由巯基会导致分析方法造成的杂 质
品作为阳性对照。
影的响封残闭余实宿验主等蛋。白如的果测成定品，中应加进入行了相可关能
验影证响以活排性除测此定种的影辅响料。，应进行相关验证
以排除此种影响。
分析方法验证——专属性
定性分析（鉴别）：样品阳性结果＋空白阴性结果＋结构相似物质的阴性结果； 杂质检查（对照品可得）：将可能的杂质对照品加入样品中； 杂质检查（对照品不可得）：
方法开发考虑
从不同正交试验或从主要和辅助试验所得的杂质量 并不是可以累加的
生物制品需要多项检测来检量其多种特性，如电荷、 分子大小等
如果一个分子包含多种修饰，则它将被多次计算， 但是降解的分子仍然只有一个
所以不同检测所得到的值是不能累加的
方法开发考虑
很多时候，峰并不能达到基线分离 可容许实验误差较大 定量限较高
这些都是要设法避免
方法开发考虑
1. 生物学活性：是反映生物技术药物质量的重要指标，通常使 用细胞或动物进行测定，误差相对较大。不同批细胞、血清、 或其它易变性物质对测定方法的准确度和精密性均有影响。
2. 生物技术药物多为生物大分子药物，具有分子量大、结构多 样性和可变性等特点，结构的细微变化可影响药物的活性和质 量。
分析方法验证——精密度
定义：对均一样品重复取样检测每个检测结果间的接近程度，RSD%,CV% 重复性repeatability：短时间内同一分析人员使用同一仪器 中间精密度intermediate precision:在同一实验室内的变化，如不同分析时 间、不同分析人员、不同分析仪器 重现性reproducibility:在不同实验室内重复
开发什么方法
适用于特定分子的方法 分子鉴定
肽图 （纯度较高） Western Blot （使用范围广） 紫外扫描图 （纯度及基质要求高） 氨基酸测序 (纯度及基质要求高，样品末端无封闭）
偶联密度
ADC （抗体药物偶联物） 抗原与载体蛋白偶联物（疫苗类药物）
结合力 抗原与佐剂相互作用
开发什么方法
适用于特定分子的方法 活性测定
Elisa（体外评价） 动物实验 （体内评价） 中和实验 （细胞测定特定表位）
降解物测定
HPLC/MS（基于标准样校正或自身对照） 凝胶电泳 （基于特异分子带） SEC/荧光光谱 （解聚或聚合）
开发什么方法
检测方法初识——电泳及毛细管电泳
USP,ChP,ICH,ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025
USP, ChP,ICH USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025 USP,EP,ChP,ICH,ISO 17025
USP,EP,ChP, ISO 17025
适用于所有分子的方法 分子大小概况
SEC（原始状态） 凝胶电泳法（非折叠（变性）状态）
病毒样颗粒概况
电镜（局部原始状态，人为影响因素大） DLS（原始状态，分辨率差，大小精准） SEC（原始状态，流动相会影响蛋白状态）
开发什么方法
适用于所有分子的方法 杂质残留量
HPLC（基于标准样校正或自身对照） GC（对残留溶剂） ICP/AAS （对元素测定） Elisa （宿主蛋白、杂蛋白测定） Southern Blot/荧光光谱 （残留DNA）
分析方法验证——验证项目
验证项目 ChP
准确性 精密度 耐用性 线性 范围 专属性 检测限 定量限
鉴别试验 杂质定量
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-不强制要求
杂质限度 活性测定
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+必须进行