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PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
2
NPTⅡ活性检测
• 目的 ：检测NPTⅡ基因在植物组织中的表达 • 原理： NPTⅡ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，
影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时 使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移， 生成放射性的卡那霉素来检测。 • 检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法 • NPTⅡ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放 射自显影
转基因植物的检测鉴定方法
• 选择和报告基因/标记基因的检测 • 转基因植物的PCR检测 • 外源基因整合的Southern杂交鉴定 • 外源基因转录的Northern杂交检测 • 外源基因表达蛋白的检测 • 生物学鉴定
1
1、选择基因检测
• 主要观察转化子在添加相应抗生素或除草 剂培养基上的生长
• 抗的存活，不抗的死亡
• 转基因在寄主染色体内的整合位点是随机的，外源DNA可以 插入任何一条染色体，也可以插入一条染色体上的任何位点， 但对转录活跃区具有优先插入特性。
– 染色体的选择、染色体上的整合位点、一个基因组中发生的整合事 件次数、一条染色体上发生的整合事件次数、一个整合位点的拷贝 数
• 规律性：外源DNA的整合较多发生在DNA同源序列区、植物 DNA的高度重复序列区。
• 外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原 理，ELISA及Western杂交是经典的方法。
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Western杂交
• 是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS 聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上， 然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是 根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特 异抗体相结合的原理而进行的。
transformation • Methods used for transgene identification • RNAi • Transgene integration and genetic mode
46
38
在RISC中，起靶序列识别作用的是siRNA的 反义链，在ATP存在时，依赖于ATP的解旋酶解开 siRNA的双链并将其正义链与靶mRNA置换，mRNA 取代正义链与反义链互补，然后由活化的RISC在 互补区的中间，距离siRNA反义链3’末端约12bp 处切断靶mRNA序列。
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RNAi的分子机制
荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG
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组织化学染色定位法检测GUS
• 以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物 水解成蓝色物质，
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gfp基因的检测
• 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光 素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内， 能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与 目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解 目的基因表达情况。
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Na+、Cl-、K+ 含量
The transgenic plants accumulate lower levels of Na+ and Cl-, but they had higher K+ under salt conditions.
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第五节
遗传转化问题及新技术
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1、转基因整合
• 转基因导入植物细胞后，通过细胞分裂时遗传物质的复制outhern鉴定
• Southern杂交技术是1975年发明 • 原理：利用两条单链DNA的碱基互补性，
来检测外源DNA的转化结果 • DNA水平
14
外源基因转录的Northern检测
• 通过Southern杂交可以得知外源基因是否整合到 植物染色体上。但是，整合到染色体上的外源基 因并不一定表达。
基
因
的
转录
表
（转运RNA）
达 翻译
（核糖体RNA）
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基因沉默，即 性状不表现
外源导入或者转
基因表达反义 RNA，抑制rRNA 和tRNA的翻译。
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RNAi
RNA 干扰(RNA interference，RNAi) ：外源或 内源性的双链RNA(dsRNA)介导的特异性地与 其同源的mRNA 结合并导致其降解，从而抑制 基因的表达，致使内源基因沉默的现象。
• 蛋白质区带-----抗体（同位素标记） • 蛋白质水平
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4、生物学鉴定及代谢测定
• 表型鉴定 • 稳定性鉴定 • 最终鉴定
• 抗病 • 抗虫 • 抗除草剂 • 花色改变 • 品质改良
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甜菜碱醛脱氢酶 （AhBADH）转枳 及其抗盐性研究
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AhBADH基因转枳及植株再生
30 days
60 days
外源基因在转基因植物中表达受到抑制的现象称 之为转基因沉默。
1986年Peerbotte报道转基烟草中转基因发生沉默
31
转基因沉默主要发生在
• 转录水平的基因沉默(TGS)：指对转 基因专一的细胞核RNA合成的失活， 转基因无法被顺利地转录成相应的 RNA而导致沉默，多发生于转录的起始
和终止, 一般只有外源基因发生沉默
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RNAi的基本原理
RNAi是一个依赖ATP的过程，在此过程中， dsRNA(外源或内生)首先被降解为具3’端有2～3nt 突出、长21～23bp 的小分子双链RNA，这种RNA 称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA通过碱基互 补配对识别具同源序列的mRNA，并介导其降解。
在RNAi过程中一种称为Dicer的核酸酶负责将 dsRNA酶切转化为siRNA，siRNA形成之后，与一 系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体 (RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶 mRNA 并使其降解，从而导致特定基因沉默。
90 days
120 days
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转基因植株分子鉴定
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转基因株系GB含量
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200 mM NaCl处理
The transgenic plants were more tolerant to salt stress than the WT
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Na+、Cl-、K+ 含量
WT #48 #51 #133
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转基因整合的遗传效应
• 位置效应(position effect)： • 重组效应(recombination effect) • 转基因沉默(transgene silencing) • 表达多样性(diverse expression)。
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2、转基因沉默（transgene silencing)
转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色 荧光，而转化含有OSPK1基因质粒的原 生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上
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3、转基因植物分子检测
• PCR • Southern blotting • Northern blotting • RT-PCR • QRT-PCR • Western blotting
• 转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞 总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称 Northern杂交。它是 RNA-DNA异质双链杂交。
• 步骤同Southern杂交法 • mRNA水平
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RT-PCR
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RT-PCR
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外源基因表达蛋白的检测
• 外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正 常表达并表现出应有的功能是植物基因转 化的最终目的。表达蛋白应具有一定的稳 定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同 时应对植物细胞无毒性。
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• GUS • GFP • LUC
2、报告基因检测
ß-葡萄糖苷酸酶基因 绿色荧光蛋白基因 荧光酶素基因
产生蓝色物质 产生绿色荧光 发射光子
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gus基因的检测
• gus基因编码 ß-葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，
能催化许多ß-葡萄糖苷酯类物质的水解。 • 检测常用底物有3种：