第二章基因工程工具酶
第—节限制性核酸内切酶
第二节DNA连接酶
第三节DNA聚合酶
第四节末端脱氧核苷酸转移酶
第五节核酸酶
第六节核酸外切酶
第七节碱性磷酸酶
第八节T4噬菌体多核苷酸激酶
第—节限制性核酸内切酶
1、宿主的限制和修饰现象
2、限制性核酸内切酶的类型
3、限制性核酸内切酶的命名
4、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性
4.1识别位点的长度识别靶序列长度4、5、6 bp居多，也有识别7、
8bp的
4.2 识别序列结构：回文对称
4.3 切割位置：（1）内部（大多数）；（2）两端（3）同裂酶与同尾酶
4.4 Ⅱ型限制性核酸内切酶不具有甲基化功能
4.5 Ⅱ型内切酶可以对单链DNA的切割
4.6 星号活性(star activity)
（1）星活性产生的原因
（2）抑制星星活性的条件(措施)
5、Ⅱ型限制性核酸内切酶的酶切反应
5.1 标准酶解体系的建立
5.2 酶切反应的基本步骤
5.3 终止反应常用方法：
（1）加EDTA：（2）加SDS（3）加热：（4）其它
5.4 多酶联合酶解策略：
（1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切
（2）对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法
5.5 DNA分子酶切常用缓冲液
5.6 内切酶对DNA分子的不完全酶解
5.7 内切酶酶解反应中的注意事项
6、影响限制性核酸内切酶活性的因素
6.1. DNA的纯度
6.2 DNA的甲基化程度
6.3 酶切消化反应温度
6.4 缓冲液(Buffer)
6.5 DNA分子的构型
6.6 反应时间
6.7 酶量使用
第二节DNA连接酶
1、DNA连接酶的发现
2、概念及其特点
3、DNA连接酶的种类
▪大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端。

▪T4噬菌体的连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平末端。

▪T4噬菌体RNA连接酶：催化单链DNA或RNA的5’磷酸与相邻的3’羟基共价连接。

4、DNA连接酶的反应体系
5、影响连接反应的因素
5.1 DNA末端的浓度
5.2 反应温度
5.3 ATP浓度
6 、DNA连接的策略
6.1 粘性末端DNA片段的连接
6.2 平末端DNA片段的末端连接法
▪ 6.2.1 常规连接
▪ 6.2.2 平末端DNA片段加接头连接法
▪ 6.2.3 平末端DNA片段的末端加尾连接法
6.3 防止自连--载体去磷酸化。