天然酶的局限
天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还
缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程.
现代生物工程的要求

能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底 物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物 的原材料 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造 或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应 用前景.
1.平板筛选法
平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细
胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。 1）依据细胞生长情况筛选突变基因 在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳 定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方 面有广泛应用。
2）依据颜色变化筛选突变基因
片断 （lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它 感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和 底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。 （2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在 平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养 一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基 酚）。
二、突变基因的筛选
（一）定向选择环境条件的设定 （1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次 突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温 度。 （2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活 性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性， 可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素 的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛 选循环中逐步提高抗生素的浓度。 （二）高通量筛选技术P217表8－2
特点 正突变的概率低，突变基因较大，筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定 向进化。
实例
枯草杆菌蛋白酶:洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重 要工业酶制剂。 Chen 等采用易错PCR 对该酶进行了体外进化研究。 他们通过降低反应体系中dATP 的浓度, 对编码该酶 从第49 位氨基酸到C 端的DNA 片段进行易错PCR , 经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF) 中酶活性明显提高 突变体PC3 在60 %的DMF 中, 酶活力是野生型的 256 倍。将PC3 再进行两个循环的定向进化, 得到的 突变体13M酶活力比PC3 还要高3 倍。
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程 大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR 等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文 库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同源 基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采 用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因 出发进行DNA序列的重新排布。

二 DNA重排技术
概念：又称片断，经过不加引物的多次PCR循 环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变 随机突变、构建突变基因、定向选择 酶定向进化的基本过程：
酶基变基因 进化酶
负突变基因
第一节 酶定向进化的特点
1 .适应面广
不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化
设计。
2. 目的性强 3. 效果显著
第二节 酶基因的随机突变
体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排
技术、基因家族重排技术 基因随机突变方法的特点P207表8－1
一 易错PCR技术
可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的
锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、 dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使 DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配 对错误的出现频率，而引起基因突变。
3）依据透明圈情况筛选突变基因

第三节 酶突变基因的定向选择
突变基因的定向选择基本过程
突变基因
体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链 DNA分子。 2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具有 自我复制能力的载体。 3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性末 端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。 4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单链 DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。

基因重组
在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体 连接在一起形成重组DNA的技术过程。 黏性末端连接 平有感染活性 的噬菌体的过程。 重组质粒载体：转化 重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白 将重组DNA进行包装，家Arnold
F H首先提出酶分 子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或 构建新的非天然酶.
酶分子定向进化
简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随
机突变和自然选择），在体外得到具有 优良催化特征的酶的突变体的技术过程。
（反复进行）
筛选
正突变基因
进化酶
三基因家族重排技术
又称为基因家族改组技术，是从基因家族
的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基 因突变的技术过程。
基因家族重排技术的基本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无 进化酶 酶切