随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。
Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。
同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)
蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介 样品制备 技术流程
1. 蛋白质组分析的技术路线
要求 流程 技术路线
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测 和分析 。
生物学问题 的提出
蛋白质样品的制备
凝胶中的蛋白
双向电泳
图像分析
转印至膜上的蛋白
溶液中的蛋白
混合肽 肽指纹图 肽序白转录后修饰的鉴定
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。
20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS)
(Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H.
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
蛋白点 的切取
图像扫描和初步分析
蛋
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
白
蛋白信息的 初步获得
质
组
分
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
其它实验 的进一步
析 流
验证
程
蛋白质组研究的基本技术路线
J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die
anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了 现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。
1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优 化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021；
此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一 般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质 点。
双向凝胶电泳的基本原理
先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的 相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。