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动物细胞培养条件
对培养条件要求严：动物无细胞壁保 护，细胞膜直接接触外界。对物理化学 因素耐受力很弱，容易受伤害。与细菌 和植物细胞相比，动物细胞培养条件要 求苛刻，周围环境十分敏感。
对培养基的要求高：需要容易利用、丰 富的相对低分子量的营养物，包括12种 必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机 盐和微量元素，多种附加成分。能源： 单糖，葡萄糖，谷氨酰氨。氮源：氨基 酸单体化合物。
很复杂，要求有多种 氨基酸、维生素、葡 萄糖、血清
非常敏感，仅能耐受 很苛刻的环境条件 进行间接（有丝）分 裂，即先有染色体的 纵裂 15-50
较复杂，要求有多种 无机盐、维生素、蔗 糖、植物生长调节剂
较敏感 间接分裂
环境影响 繁殖方式
倍增时间/时 2013-9-22
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动物细胞大规模培养方法
优点：操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧
悬浮培养
较好，容易扩大培养规模； 缺点：由于细胞体积较小，较难采用灌流培养。 主要设备：通气搅拌灌式和气升式。
贴壁培养
优缺点与悬浮培养正好相反。 常用设备：转瓶和固定床式生物反应器。另外，贴 壁培养在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从 基质上消化下来。

微载体培养
成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养
4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个 体？
不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体
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项目
大小/μm
微生物细胞
球菌φ0.5-φ1 杆菌φ0.5-φ7 放线菌φ0.5-φ1.4 酵母φ1-φ30 有，细菌由氨基糖及 壁酸为主组成 以悬浮为主
有SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生
长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。
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常见生产用动物细胞系
昆虫细胞株系
Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到 的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。
纤维（fibroblast）细胞系，贴附型生长，2n=46。细胞倍增时间24小时，寿命50
代，第一个被用于制备疫苗。
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常见生产用动物细胞系
哺乳动物细胞株系
CHO细胞：从中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）中分离的上皮样 （epithelial）细胞系，贴附型生长体性，是目前使用最为普遍和成熟的宿主细胞。 属于贴壁生长细胞，可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白 质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。 BHK：从幼仓鼠的肾脏（baby hamster kidney, BHK）中分离的成纤维样细胞， 非整倍体，2n=44。用于增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白。两种重组凝血因子Ⅷ， Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分别于1989和1994被FDA获 准上市，1999年FDA批准Novo Nordisk的重组凝血因子VIIa（NovoSeven）上市， 用于治疗血友病。 杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，
哺乳动物细胞
淋巴细胞 其他大小约为φ10-φ100
植物细胞
φ20-φ40 φ100-φ1200
细胞壁 液体培养生长方式
无，其细胞膜由类脂 和球蛋白组成 以贴壁为主
有，由纤维素、果胶 为主组成 以悬浮为主
营养要求
简单，以碳水化合物、 无机及有机氮源、微 量元素为主
一般，可耐受较粗犷 的环境条件 细菌及放线菌以繁殖 为主；酵母以芽生为 主；霉菌以形成孢子 繁殖为主 0.5-5
生物制药工艺学
Biopharmaceutical Technology
第五章 动物细胞工程制药技术
动物细胞工程主要应用技术 细胞培养 细胞融合
动物细胞工程是指按照人们预 定的设计，根据细胞生物学及 工程学原理定向改造动物细胞 遗传性的技术。
单克隆抗体
动物细胞工程
核 移 植
胚胎移植
动物细胞反应动力学、动物细胞反应器
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合成培养基是用化学成分 明确的试剂配制的培养 基，组分稳定，可大量供 应。在动物细胞培养中最 常用培养基7－8种，如 BME、MEM、DMEM、 IMEM、M199等。合成培 养基中添加5％-10 ％的小牛血清。在杂交瘤 培养中，一般为10％～20 ％的胎牛血清。血清的加 入对培养非常有效，但对 培养产物的分离纯化和检 测会组成一定的不便。
无血清培养基（serum free medium, SFM）是全部用已 知成分组配的不加血清的合 成培养基，通常加入适宜的 促细胞生长因子，保证细胞 良好生长，是最适合于制药 生产的培养基。产品纯化容 易，组分稳定，可大量配 制。已有各种无血清培养基 上市。 已有商品化的无血清培 养液，如淋巴细胞无血清培 养基、内皮细胞无血清培养 基、杂交瘤细胞无血清培养 基、巨噬细胞无血清培养基 等。
血液中有四个缓冲体 系，碳酸盐、磷酸盐、 血红蛋白和血浆蛋白 缓冲体系。
渗透压
正常血浆渗 透压范围为 （690～ 859kPa）
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动物细胞培养基的制备
培养基
天然培养基是直接取自于动 物组织提取液或体液作 为培养基，如血浆凝块、血 清、淋巴液、胚胎浸出液 等。营养价值高，但成分复 杂，而且不稳定，来源也受 到限制，不宜大量培养和生 产使用。 血清是天然培养基中最有 效和最常用的培养基，来源 有胎牛血清、新生牛或成牛 血清、马血清、鸡血清、羊 血清及人血清，最广泛应用 的为胎牛血清和新生牛血 清。
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动物细胞培养过程的检测与工艺控制
细胞活性与形态检测
溶解氧的检测与控制
培养基成分检测与代谢控制
基质消耗的检测 、 代谢控制
pH值检测与控制
温度检测与控制
搅拌剪切检测与控制
目标产物的检测与控制
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动物细胞培养技术的应用
• 蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体
基本概念
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种 传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状 态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养 条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具 有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
使细胞贴附载在微小颗粒载体上，贴附面积大，供 细胞贴附生长、增殖。载体体积很小，比重较轻， 在轻度搅拌下即可使细胞自由悬浮于培养基内，充 分发挥悬浮培养的优点。理想的微载体有葡聚糖、 聚丙烯酰胺、明胶或纤维素
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动物细胞大规模培养的操作方式
分批式 半连续式 灌流式
当细胞和培养基一起加入反应器 后，在细胞增长和产物形成过程 中，不断地将部分条件培养基取 出，同时不断地补充新鲜培养 基。
受一种抗原决定簇的刺激，大量增殖形成一个具有相同遗传特性的细胞
克隆群，产生一种化学结构完全相同，在结构上与抗原决定簇互补的特 异抗体即单克隆抗体。因此，进入机体的每一种抗原能被针对其不同抗
原决定簇的各种抗体所识别，而每一种抗原决定簇又可由1000-8000种
不同的抗体所识别。
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概
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动物细胞大规模培养的操作方式
简单连续培养装置
1－培养基贮槽 2－流出液接受器 3－蠕动泵 4－恒温水浴 5－磁力 搅拌器 6－培养槽中搅拌转子 7－温度调节器 8－培养基加入管 9－培养液 流出管 10－输送管
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动物细胞种质保存
动物细胞种质保存的形式有组织块、细胞悬浮物及细 胞单层培养物等。保存方式有常温（20-30℃）、低温 （4℃）及超低温冰冻法（-70℃）3种。
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
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常见生产用动物细胞系
人源细胞株系
Namalwa：从淋巴瘤病人中分离获得的类淋巴母细胞，非整体核型，2n=12～ 14，单X染色体，无Y染色体。表达IgM悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用 无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大 规模生产干扰素，并批准上市。 WI-38:美国Wistar研究所从正常人胚肺组织分离获得的二倍体（diploid）成
动物细胞培养的基本过程
动物胚胎或幼龄动物的 组织、器官
胰蛋白酶 剪碎
单个细胞
制成 原 代 培 养
细胞悬 浮液
细 胞 贴 壁
细胞系 部分细胞“癌变”， 无限传代
细胞株
细胞
动物细胞培养不能 最终培养成动物体
50代细胞
剥离、分瓶 传代培养
10代细胞
实例
取动物器官 和组织
幼龄鼠
剪碎组织
胰蛋白酶处理
细胞培养 单个细胞
动物细胞培养 基本概念 动物细胞大规模培养方法 动物细胞培养操作方式 动物细胞培养条件 动物细胞培养基的制备 动物细胞培养过程的检测与工艺基的制备
基本概念
动物细胞培养：就是从动物有机体中取出相关的组织， 将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中， 让这些细胞生长和增殖。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。 培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培 养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养， 称为传代培养。