加强疫苗生产用Vero细胞的控制洪小栩李琦涵摘要：目前，传统病毒性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系、二倍体细胞系和传代细胞系。
近年来，Vero细胞作为连续细胞系在我国越来越多地用于人用疫苗的生产。
由于Vero细胞具有污染内源性或外源性感染因子以及细胞残留蛋白和DNA 具有潜在致瘤性和致癌性的风险，因此， Vero细胞系作为疫苗生产用细胞基质的安全问题备受关注，加强生产用Vero细胞库的管理和控制；优化疫苗生产工艺，提高对细胞残余蛋白和DNA的去除能力；执行严格的残留量限定标准，对保证Vero细胞生产疫苗的安全性具有重要意义。
关键词： Vero细胞、病毒性疫苗、致瘤性、致癌性Strengthening the Control on the Vero Cell Used for the Production of Viral VaccinesHong Xiaoxu Li QihanAbstract: At present, the major cell substrates used for the traditional production of viral vaccines including the primary cell lines, diploid cell lines and continuous cell lines. The safety of the Vero cell strain is the main concerned on the potential risks of the endogenous and exogenous virus contamination, as well as the tumorigenicity and oncogenicity properties induced by the residual cellular protein and DNA. As this result, it will play very important role on improving the safety of viral vaccines by strengthening the management and control of the Vero cell bank, improving the production process, enhancing the ability of the removing the residual cellular protein and DNA, and carrying out the strict limit standard.Key words: Vero cell, viral vaccine，tumorgenicity, oncogenicity作者单位：100060.北京. 国家药典委员会（洪小栩）；650118 昆明，中国医学科学院医学生物学研究所（李琦涵）通信作者：洪小栩， Email： hongxiaoxu@一、 背景日本千叶大学的Y.Yasumura 和Y. Kawakita 两位学者于1963年研制出Vero 细胞系，来源于非洲绿猴肾(Cercopithecus aethiops)上皮细胞。
1964年，Simizu 博士将第93代的Vero细胞提供给英国的Tripical病毒实验室（NIAID, NIH）。
1979年，第113代Vero细胞提供给美国标准菌种保藏中心（America Type Culture Collection, ATCC），传代至第121代建立细胞库。
Vero细胞为连续细胞系，可在体外连续传代，并对多种病毒敏感，包括SV-40, SV-5、麻疹病毒，虫媒病毒、逆转录病毒, 风疹病毒、猴病毒、腺病毒, 脊髓灰质炎病毒, 流感病毒, 副流感病毒, 呼吸道合胞病毒、牛痘病毒等多品种病毒。
因此，Vero细胞制备后被就广泛应用实验室的相关生物学检测，如病毒扩增和空斑检测等二、Vero细胞在疫苗生产中的应用法国梅里厄研究所最早对疫苗生产用Vero细胞的特性进行了深入的研究，二十世纪八十年代，该公司采用Vero细胞生产的脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）、口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）以及人用狂犬病疫苗相继在法国批准上市。
1990年，美国批准了IPV的注册申请，批准用于儿童的免疫[1]。
自二十世纪九十年代以来，是Vero细胞用于疫苗研制发展最快的时期，多种病毒性疫苗相继获得批准。
近十来，我国病毒性疫苗的研究也取得了快速发展，新型疫苗不断涌现， 特别是病毒性灭活疫苗，需要更大规模的病毒培养以获得更多病毒抗原；同时，随着先进的细胞培养技术，如生物反应器、 发酵罐细胞悬浮培养技术的推广应用，也使得更多的生产企业倾向选择Vero细胞进行病毒性疫苗的生产。
表1 国内外采用Vero细胞生产疫苗的情况国家制品美国脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）天花疫苗口服轮状病毒[2]欧洲脊髓灰质炎疫苗人用狂犬病疫苗（Vero细胞）流感疫苗(Vero细胞)天花疫苗[3]中国人用狂犬病疫苗（Vero细胞）双价肾综合征出血热灭活疫苗（Vero细胞）冻干乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）[4]甲型肝炎灭活疫苗（Vero细胞）肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）*脊髓灰质炎灭活疫苗 *注： *为在进行进行临床考核的制品三、 Vero细胞的特性目前，传统病毒性疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系（Primary cell lines, PCLs）、二倍体细胞系(Dipoild cell lines, DCLs)和传代细胞系（Continuous cell lines, DCLs）。
虽然PCLs和DCLs作为细胞基质风险性较低，但也存在诸多的缺点，比如，PCLs在制备过程中存在容易污染内源性或外源性感染因子的污染；产量低，成本高；制品细胞批间差异大等问题；同时存在伦理方面的异议。
对于DCLs而言，由于有限度传代，因此存在生产量小，对培养基的条件要求较高、不易大规模生产等问题。
而Vero细胞由于其细胞特性，具有无限的寿命，具有生长快速，容易培养，对培养基的条件不高、可用于现代的培养方式，如生物反应器的培养，适用于大规模的病毒培养，对于需要较高抗原量的病毒性灭活疫苗的生产，解决了生产规模瓶颈的问题。
与此同时，Vero细胞用于人用疫苗的生产也存在诸多问题，一是细胞系中存在潜在感染性因子的风险，这些潜在的感染性因子可能是目前对于连续细胞系质量控制规定的检测方法所不能够检测出的；二是参与宿主蛋白和宿主DNA 可能导致致瘤性和致癌性的风险[5]。
加强生产用Vero细胞安全性控制引起全球广泛关注。
当前，我国越来越多的疫苗产品采用Vero细胞进行生产，加强生产用Vero细胞的控制，是保障产品安全性的前提。
疫苗生产企业无论是对已上市的产品还是在研制品，应重点考虑一下几方面问题。
1. 加强Vero细胞库的管理和检定多年来，尽管PCLs和DCLs已成功用于疫苗生产，并在安全方面得到有效的证明，认为这类细胞DNA残留无任何风险，但CCLs由于调控生长基因失调而具有无限的寿命。
因此认为，来源于CCLs的 DNA 有可能致使其他细胞生长失控或产生致瘤性[6]。
早期研究证明Vero细胞具有致瘤性，采用无胸腺小鼠和Syrian 豚鼠进行试验，豚鼠检测结果为阴性，小鼠接种部位出现结节。
其他肿瘤细胞如Hela、 Hep-2细胞接种动物，没有发现治转移瘤。
接种免疫缺陷新生小鼠，90%以上出现肿瘤生长；3周后 40% 动物肺部出现转移瘤。
但将Vero细胞传至第169代接种动物为发现致瘤性[7]。
WHO 指南中指出，采用新生小鼠研究表明，细胞代次在P134-P150代之间接种动物不会产致致瘤性[8]。
由此，应尽可能使用早代的Vero 细胞用于疫苗生产，降低Vero细胞致瘤性/致癌性的风险。
通常规定在137代建立主或工作细胞库，在142代用于疫苗生产。
[9]WHO 生产用Vero细胞库的主细胞库为第134代，并规定疫苗生产用最高传代次数不高于第150代。
我国疫苗生产用Vero细胞一般来源于中国食品药品检定研究院或ATCC，生产企业从中检院获得的细胞代次一般在第126-127代，生产疫苗的细胞代次在148代以内；从ATCC获得的细胞代次一般在127代，疫苗生产用细胞的高限定代次不超过150代。
另外，Vero细胞株应有非常明确的来源和传代背景。
研究表明，对于不同核型的Vero细胞株其致瘤和致癌性存在较大差异[10]。
因此，应选用经过全面检定、目前已经普遍被WHO认可并已经获得批准的用于疫苗生产。
同时应规范细胞传代的方式，并按照相关要求对细胞库进行全面的检定。
同时，国际上对生产用Vero西坝的控制也在不断提出新的要求, 正在讨论的WHO关于人用疫苗生产细胞基质规程中对CCLs细胞拟增订致癌性检测。
2. 加强Vero细胞污染感染因子的控制通过免疫缺陷动物模型试验表明，Vero细胞可能含有并表达内源性病毒。
同时，细胞DNA有可能插入外源性逆转录病毒的前病毒基因序列。
因此，加强对生产用Vero细胞外源因子的控制对于保证制品安全性至关重要[11]。
在细胞库建库过程中以及生产终末细胞，均要求对内源性和外源性病毒进行检定。
检测方法除了采用常规的动物体内实验和体外培养法外，还应不断采用更为先进、成熟的检测技术，包括采用增强电镜法、PCR扩增技术、基因测序分析以及RNA 转录等，提高检测方法灵敏度，确保使用的Vero细胞无内源性或外源性病毒污染[12]。
3. 执行严格的Vero细胞DNA残留限定标准目前，国际上对于细胞DNA可导致的致瘤性仍是热议的焦点。
根据动物致癌基因模型的风险性评估显示，体内暴露1ng的细胞DNA（基因组中含有某一具有活性的致癌的100拷贝）可引起1/109个受体发生转化。
因此，研究认为，当细胞残留DNA不高于100Pg/剂量时，CCLs细胞DNA潜在的风险可忽略不计。
在制定残留DNA 的限定标准时，主要考虑的不是DNA本身，而是减少编码具有活性致癌基因的DNA序列。
另外研究也发现，细胞DNA 嵌入突变可导致瘤变的的危险性很低，通过嵌入性突变方式，10ug DNA 可导致疫苗接种者的一个细胞的1/107个受体的2个独立肿瘤抑制基因失活。
不过，近年来也有发表的相关数据表明，mg 级的来源于人类肿瘤细胞具有致癌基因的DNA，对灵长类动物进行的长达10年的评价观察未造成肿瘤的发生。
另外，生物制品中含有的DNA 通常是以片段形式存在，不太可能编码功能性基因。
根据目前的认识来看，传代细胞的DNA可视为是细胞的污染，而不是作为一种重要的风险因素需要去除到极低的水平[12]。