细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。
一、细胞冷冻保存1、材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650) 、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061) 、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：⑴传统方法：冷存管置于4 °C 10分钟--->-20 °C 30分钟--->-80 °C 16〜18小时(或隔夜)---> 液氮槽vaporphase 长期储存。
-20 C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
⑵程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1〜-3 C /分钟之速度由室温降至(-80 C以下)-120 C,再放在液氮槽vaporphase 长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
3、步骤：(1) 冷冻前24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
(2) 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜(DMSO) 至20% 浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
(3) 离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。
(4) 取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO 最后浓度为5〜10%)，使细胞浓度为1〜5 x106cells/ml ，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1〜2ml/vial ，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：(1) 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80 ~90%致密度。
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2) 细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70 度可保存数月。
(3) 注意冷冻保护剂之品质。
DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5〜10ml小体积分装，4 C避光保存，勿作多次解冻。
Glyce⑹亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。
缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。
DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
(4) 冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1 〜3 X106cells/ml②hybridoma:1 〜3 X106cells/ml ，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。
③adherent tumor lines:5 ~7 X106，依细胞种类而异。
Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需 1 〜3 X106cells/ml④other suspensions:5 〜10 X106cells/ml ，human lymphocyte 须至少 5 X106cells/ml 。
(5) 冷冻保护剂浓度为5 或10%DMSO ，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture ，以防止冷冻失败。
(6) 冻存可用10%〜90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时)，复苏存活率在80%〜90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料37 C恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：(1) 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2) 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
(3) 将新鲜培养基置于37 C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
(4) 取出冷冻管，立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
(5) 取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10〜1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
取0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6) 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol) ，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。
惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml 培养基之离心管内，离心1000rpm ，5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。
(7) 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试1 、原理：(1) 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter 粒子计数器自动计数。
(2) 血球计数盘一般有二个chambers ，每个chamber 中细刻9 个1mm2 大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1mm 。
当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml 。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。
(3) 存活测试之步骤为dyeexclusion ，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue ，则用红色之Erythrosin bluish 。
计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)X100%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain; 取0.1gram Erythrosinbluish(SigmaE-9259) 及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647) 溶于100mlCa++/Mg++freesaline; 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip); 计数器(counter); 低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics) 。
白细胞稀释液(4% 乙酸溶液)。
3、步骤：(1) 取50讪细胞悬浮液与50讪trypan blue(orErythrosinbluish) 等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2) 取少许混合液(约15讪)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish) 。
(3) 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数x稀释倍数x 104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm x o.lcm x0.01cm=10-4ml 计数板计数时，最适浓度为5〜10 X105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59;死细胞数/方格：5，3，4，6;细胞总数=243 平均细胞数/方格=60.75; 稀释倍数=2;细胞数/ml : 60.75 X104 X2(稀释倍数)=1.22 X106;细胞数/flask(10ml) : 1.22 X106 x i0ml=12.2 X106 存活率：225/243 = 92.6%在细胞复苏过程中经历多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，上述是个人总结的细胞冻存复苏及细胞计数的操作程序和注意事项，望能为各位同学提供些参考。