自噬现象的观测高玲1,2*，张卫娜2,4*，陈文利2,31.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109；2.华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州510631；3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631；4.广东省农业科学院，广州510640收稿日期：2011-03-23；接受日期：2011-04-29基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0829)，广东省科技攻关项目(2007A020300008-6)，华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目通讯作者：陈文利，电话：(020)85211436-8512，E-mail ：chenwl@*并列第一作者摘要：镉离子(Cd 2+)具有强植物毒性，可抑制植物生长，甚至导致植物死亡。

为了研究重金属镉对拟南芥的毒害作用，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定量RT-PCR 技术，检测光合参数的变化、活性氧(reactive oxygen species ，ROS)的累积、自噬的发生，以及病原相关蛋白（pathogenesis-related protein ，PR ）基因表达的变化。

实验结果显示，随着50μmol/L CdCl 2处理时间的延长，ROS 和Cd 2+在细胞中大量积累。

而在镉胁迫的初期，会观察到自噬的发生及PR 基因表达的变化。

说明植物受到外界Cd 2+作用的初期，会通过自噬及增强PR 基因表达来抵抗外界胁迫。

但随着处理时间的延长，植物细胞内累积了大量的ROS 和Cd 2+，当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时，就会导致生长受阻，最终对光合系统造成损伤。

关键词：镉；活性氧；自噬；叶绿素荧光；流式细胞技术中图分类号：Q945，Q947DOI ：10.3724/SP.J.1260.2011.00676引言近年来，工业、矿业生产中产生的大量重金属被释放到环境中，镉(Cd )即是其中之一。

大量研究表明，镉是环境中的主要重金属污染源，是对植物毒性最强的元素之一。

镉毒害同其它逆境一样，主要伤害机制之一是影响植物体内活性氧(reactive oxygen species ，ROS )和自由基的代谢平衡，引起ROS 和自由基的积累，产生膜脂过氧化作用，导致植物的中毒甚至死亡[1]。

植物体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD )和过氧化氧酶(catalase ，CAT )等保护酶对ROS 及自由基的清除能力，是决定其逆境抗性的重要因素之一[2]。

镉胁迫成为各种生物面临的一种新挑战。

植物和藻类细胞虽然可以耐受一定量的镉胁迫[3]，但过量的镉会直接或间接地抑制植物体的生理过程，如呼吸作用、光合作用和氮代生物物理学报2011年8月第27卷第8期:ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27No.8Aug.2011:676-686676-686676ROS的产生及基因表达的变化。

在分子水平，镉能够影响巯基(-SH)和金属鳌合键的形成与分离、蛋白质的二级结构和细胞内氧化还原状态的改变，还会影响植物对其生长所必须的金属元素的吸收、转移和代谢[8]。

另外，在生物体内，镉能使在氧化还原或电子转移过程中发挥重要作用的金属蛋白质发生毒化，致使自由基增多，导致蛋白质、脂类及其它生物分子发生非特异性破坏[9]。

但目前对于镉胁迫引起植物细胞死亡的机制依然不明。

本实验以作为影响因子，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定外施CdCl2溶液处理的不同时间点，检测拟南芥生长及其光合参数的变化、量RT-PCR技术，在CdCl2ROS的积累、自噬的发生，以及相关基因的表达情况，为监测重金属胁迫对植物的损伤作用提供简单便捷的方法，同时为揭示植物对Cd2+的响应机理提供实验依据。

材料和方法拟南芥的培养和原生质体的分离拟南芥种子哥伦比亚野生型和突变体atg2(购买于The Nottingham Arabidopsis StockCentre，由于ATG2基因的缺失，突变体不能发生自噬现象，且正常生长条件下也会表现出早衰现象)，经1%次氯酸钠溶液表面消毒后，用无菌水浸泡，置于4℃冰箱低温春化处理3d。

播种后在人工培养室培养，培养条件为16h光照、8h黑暗，光照强度120μmol/L·m2·s，温度22℃，相对湿度82%。

待幼苗长至28～35d左右时，取大小均一、生长一致的植株进行相关实验[10]。

提取原生质体时，用锋利的刀片将拟南芥叶片切割成0.5～1mm的长条。

将大约10～20个叶片溶解于5～10ml的酶解液〔1%～1.5%纤维素酶R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)，0.2%～0.4%离析酶R10(Yakult Honsha，Tokyo，Japan)，0.4mol/L甘露醇，20mmol/L KCl，20mmol/L MES(pH5.7)，10mmol/L CaCl2〕中，抽真空20～30min后，置于黑暗中继续酶解3h。

用孔径为35～75μm的尼龙网过滤，加W5溶液〔2mmol/LMES(pH5.7)，154mmol/L NaCl，125mmol/L CaCl2，5mmol/L KCl〕，使细胞悬浮，100g离心力下离心3min，重复离心三次，将下层原生质体小心地悬浮于W5溶液中，悬浮浓度1～2×105/mL[11,12]。

每组实验重复三次。

实验方法叶绿素荧光参数的测量应用Imaging-PAM便携式叶绿素荧光仪(Walz，Germany)，测定不同实验组叶片的叶绿素荧光参数。

测定前，将叶片放置到Imaging-PAM型荧光仪匹配的暗适应夹中适应25～30min。

测定时，将拟南芥的叶片放置到样品室，打开检测光(0.1μmol/m2·s)，测定初始荧光(F o)；然后照射饱和脉冲光(3000μmol/m2·s)，每2.5s1个脉冲，测定最大光化学效率677｜ACTA BIOPHYSICA SINICA子激光器，LTG(LysoTracker@Green DND-26，用于自噬小体的检测)[13]和Leadmium TM Green AM dye(用于Cd2+的检测)(MolecularProbes，Invitrogen，Calsbad，CA，USA)[14]的荧光用488nm的激发光激发，选择合适的分色镜后，通过500～550nm的带通滤光片探测；叶绿体自发荧光的激发波长为488nm，使用650nm的长通滤光片接收。

物镜为100倍的油镜。

图片使用Zeiss Rel3软件处理。

将叶片和提取好的原生质体悬浮于细胞培养皿(悬浮浓度2×105原生质体/mL)并用荧光染料孵育染色后，置于黑暗处20min，然后用50μmol/L CdCl2溶液处理2h，置于共聚焦显微镜下观察。

流式细胞技术分析活性氧的变化提取的原生质体经W5反复洗涤三次后，加入荧光染料2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)(终浓度为5mmol/L)，于黑暗中静置染色10～15min，再加入50μmol/L CdCl2溶液处理不同的时间，用流式细胞仪FACSCanto Ⅱcytofluorimeter(Becton Dickinson，Mountain View，CA，USA)观察活性氧的变化。

激发波长为488nm。

RNA的提取及半定量RT-PCR选取3周大小的拟南芥植株，用CdCl2处理一定时间后提取总RNA，然后根据其OD260确定RNA浓度。

根据说明书The SuperScriptⅡFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)反转录合成第一链cDNA后，进行半定量RT-PCR实验[15]。

引物设计见表1。

Gene Primer sequence Fragment length(bp)ACTIN PR1 PR25'-AACGATTCCTGGACCTGCCTCATCATACTC-3'5'-AGAGATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3'5'-CGTCTTTGTAGCTCTTGTAGGTGCTCTTGTTC-3'5'-GTATGGCTTCTCGTTCACATAATTCCCACGAG-3'5'-ATGTCTGAATCAAGGAGCTTAGCCTCACCACC-3'5'-GTTGAAATTAACTTCATACTTAGACTGTCGATCTGG-3'3534511017表1文章中用到的引物序列Table1The primers used in this paper数据分析结果为重复三次的实验数据，采用Microcal Origin 6.0绘图软件和SPSS11.5统计分析软件进行数据分析。

结果与分析镉胁迫对拟南芥生长及其叶绿素荧光参数的影响50μmol/L CdCl2对野生型拟南芥植株生长及其叶绿素荧光参数的影响如图1所示。

678ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27No.8｜Aug.2011 ｜ACTA BIOPHYSICA SINICA高浓度的Cd 2+造成植物生长受阻，并表现出植株生长缓慢、植株矮小、叶片褪绿等中毒症状，严重影响作物产量与质量，甚至会导致植物的死亡[11]。

分别用50μmol/L 的CdCl 2溶液浇灌处理拟南芥植株5、10和15d ，最后同时采撷样品进行实验观察，发现处理不同时间的拟南芥，其地上部分及根长都有很大的差异。

从图中可以明显看出，进行CdCl 2处理后，虽然是在营养土中生长相同的时间后取材，但处理5和10d 的植株与对照相比，其根长和地上部分的生长均受到抑制。

随着作用时间的延长，植物根的生长受到显著抑制，叶片生长缓慢且逐渐变黄(图1A )。

很显然，CdCl 2溶液处理对拟南芥的生长有非常强的负面效应。

其次，CdCl 2胁迫后，荧光参数F v/F m 显著降低，F o 上升，而NPQ 呈现出先上升后下降的趋势(图1B ～D )。

F v/F m 表示PS Ⅱ的最大光化学量子产量，即PS Ⅱ的原初光能转换效率，被用作表征环境胁迫程度的指标和探针[16]。

经过15d 的CdCl 2处理，F v/F m 从0.806±0.006下降到0.727±0.007(P <0.05)，图1C 表明，Cd 2+使PS Ⅱ反应中心受损，抑制光合作用的原初反应，阻碍光合电子传递的过程。