第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
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章
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概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
二、外周血单个核细胞的分离
人血液中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090 血小板：1.030~1.035 单个核细胞包括：淋巴细胞和单核细胞。
分离血细胞常用的分离剂为：Ficoll和 Percoll分离剂 1、 Ficoll分层液
主要用于分离外周血中的单个核细
方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离 细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与 相应的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合 物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明 显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于 强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限， 而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来， 再将该柱移出磁场，与结合的细胞也将被洗 脱下来，达到分离目的。
第四节 淋巴细胞的保存和活力测定
1、分离细胞的保存 （1）短期保存
用含有10%~20%灭活小牛 血清的Hanks、Tc-199、 RPMI 1640培养液可保存数周。
（2）长期保存及复苏 保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-
196℃)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞 作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含 有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的 细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过
1、自然沉降法 外周血， 抗凝，静置约一 小时血液分为三层，上层为血浆，底层为红 细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为WBC， 轻轻吸取此层即可得到富含WBC悬液，低 渗破坏RBC，洗涤即可。
2、聚合物加速沉淀法 常利用高分子量的聚合物如明 胶、右旋糖酐等，将红细胞快 速沉降，从而分离出白细胞。 本法的细胞获得率比自然沉降 法高。
第三节 吞噬细胞的分离和收集
一、Percoll分离法 此法从外周 血中分离出单核-巨噬细胞，但由 于此类细胞在外周血中的含量较 低，分离时所需的血量较多。
二、斑螯敷法 此法可从人体组织液
中获取较纯的吞噬细胞。其方法是： 用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液， 贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5小时后皮 肤局部充血，48小时后局部形成水泡， 吸取水泡中的组织液，内含大量巨噬 细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤， 有时可引起局部感染。
（3）亲合板结合分离法—分离亚群 方法：将所需的细胞对应的单克隆抗体包被 于小管内→加入淋巴细胞→形成Ag-Ab复合 物→洗去不反应的物质。
（4）荧光激活细胞分离仪法
荧光激活细胞分离仪(FACS)主 要由4部分组成:细胞流动系统 及气压流速控制系统;激发系统; 检测与讯号处理系统;细胞分选 ห้องสมุดไป่ตู้统。
(2)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗
脱下来的主要是淋巴细胞
(3)磁铁吸引法 利用单核细胞具有吞噬的特性，
在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核 细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞 吸至管底，上层液中含较纯的淋巴 细胞群。
2、淋巴细胞亚群的分离
分 离 阳性选择法：纯化所需的细胞
方 法
阴性选择法：去除不要的细胞，留下所需细 胞
其原理是：细胞经荧光染色后，通过高
速流动系统，细胞排成单行，逐个流经 检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴 处流出时，超声振荡动液流，使液流断 裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小 滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照 射产生荧光和散射光，由光电倍增管接 收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理， 分辨细胞的类型。
第一节 免疫细胞的分离
用体外方法对机体各种具有免疫
反应的细胞分别作鉴定、计数和功能 测定，是观察机体免疫状态的一种重 要手段。为此，须将各种参与免疫反 应的细胞从血液中分离出来。参与免 疫的细胞主要包括：淋巴细胞、巨噬 细胞、中性粒细胞等。
一、白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600~1000： 1，两者的比重不同其沉降速度也不同，通 常用两种方法加以分离。
（5）磁性微球分离法
磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行外理， 微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材 料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质 （抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被有免 疫物质者称为免疫磁珠，其兼有免疫配基的性质 和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场 时磁性消除。目前商品出售的磁珠有直径为 1~5um等不同的规格，表面活性基团有氨基（－ NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH）等， 包被的免疫物质有：一抗、二抗等。