粪便涂片法检查菌群失调标准操作规程
一、革兰染色液的配制（科氏改良法）
共5种液体，分为结晶紫A液，结晶紫B液，革兰碘液，脱色液，复染液。

二、涂片制作
1、取样：
粪便标本送检时，观察标本性状，并“多位点”挑取或沾取粪便标本；
2、推片与固定：
以30~40度角推片，面积1~1.5×2cm，自然干燥后，酒精灯上火焰上能过3次固定（制作涂片2张，其中作为一张备用）；
3、染色：
第一步，先加A液淹没标本，再加“等量”B液混合，染色1分钟；水轻柔冲洗掉；
第二步，加革兰碘液，1~2分钟；水轻柔冲洗掉；
第三步，加脱色液20秒到30秒，根据情况而定，如涂片稍薄时就适当减少染色时间；水轻柔冲洗掉；
第四步，最后复染30秒，冲洗后晾干或吸干。

4、涂片制作注意要点：
1、涂片不可太厚，亦不可太薄，太厚则细菌总数增加，且影响观察，太薄则涂片所见细菌总数减少，厚薄如血膜为宜。

2、注意把握染色时间，好的染色是能够清晰准确观察的必要条件。

三、镜下观察
1、确定涂片和染色情况：涂片要均匀，菌体不变形，革兰阳性和革兰阴性反差要好。

2、总览细菌总数：观察总数的多少，以及有无优势菌或真菌等。

其评定标准见《肠道粪便检查图谱》。

3、观察G+杆菌、G+球菌、G-杆菌、G-球菌比例：选定有代表性的视野，计数并判定其大概比例（有经验者可根据经验判定）。

计数方法可选用纸片打孔缩小视野计数法来计数；亦可选定有代表性视野，数一定数量的细菌，再计数各种比例。

四、结果判定:
请按照下表进行参照填写每个患者的菌群失调化验单（四联活菌肠溶胶囊临床试验专业）
五、其它说明：
1、尽量用新鲜粪便进行检测，时间半小时之内，如果耽搁时间较长，可以取稍微量多的粪便样本，取样时挑取中心位置的粪便。

2、遇粘液便，胨样便或水样便亦可采用牙签进涂片。

3、镜检时，应将涂片视野全面观览，不可只看几个视野就计数或报告，以防误差。

六、参考文献：
张秀荣. 肠道菌群粪便涂片检查图谱[M].北京：人民军医出版社，2000.1-25.
制作：杭州龙达新科生物制药有限公司研发部
日期：2008年4月。