器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出， 置于体外生存、生长并同 时保持其一定的结构和功 能特征。
组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米） 置于底物上孵育，细胞自 其周围移出并生长。
细胞培养(cell culture)： 把提取的组织用机械或消 化的方法分散成单个细胞 悬液，后进行培养，增殖。
粘着、粘附 （attachment）
铺展 （spreading)
组织块培养法
1）取材 → 切割
（原代培养） 消化培养法
2）直接购买 → 培养
传代
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以 便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起 营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率 转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
1907年Harrison 和1912年 Carrel开始把组织培养作为一种 方法，用于研究离体动物细胞 的培养。
他建立的鸡胚胎成纤维细胞 持续了34年之久(1912-1946)
Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944
主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液：
生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hank’s常用于配制胰酶溶液）
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
配制
具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注 射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭 菌双蒸水，即每毫升各为20万U。
传代细胞：在体外培养条件下持续 传代培养的细胞
无菌
无毒、生物相容性
清洁的环境
品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和 去离子水
有标准化的工作方法
培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确， 所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否 和制备日期等
一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章， 其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放
消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。
物品 湿热 干热 过滤 紫外
培养室 工作台＋Fra bibliotek玻璃 制品
＋
＋
金属 器械
＋
＋
塑料 制品
橡胶 制品
＋
培养 用液
＋
＋
布类 棉类
＋
＋
化学 气体
消毒剂
电离 辐射
＋＋
＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
4.细胞培养的基本方法
贴附生长型细胞 必须贴附于底
物才能生长的细 胞。从形态上大 体分为上皮细胞 型及成纤维细胞 型，还有一些难 以确定其稳定形 态的细胞。
× ×
基础培养基 血清 青、链霉素
80％～95％ 5％～20％ 各100U／ml
天然培养基： 血清
血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）
合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法
模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合
物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和
前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测
1.前言
1885年Roux最早尝试使组 织离体培养，材料是鸡胚神经 板，采用生理盐水为培养液， 并首次采用组织培养这个术语。
Wilhelm Roux (1850-1924 )
肿瘤
胚胎
成体
粗切
消化
细切
修切
细胞培养 组织培养 器官培养
活细胞 便于观察检测 条件可控 均一性 便于人工筛选
失去原有组织结构和形态，趋向单一性 分化减弱 可能获得不死性
贴壁型：动物的正常细胞 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 固定化培养
来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞
使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最 终为100U/ml。
庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。
主要作用：
水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋 白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。
常用浓度：0.25%
用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤 器过滤除菌。
无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高 效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工 作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌 器，抗生素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱， 培养基，血清
细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板 震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动
原代细胞：从机体取出后立即培养 的细胞
原代培养：将从体内取出的细胞进 行培养
传代培养：从原代培养细胞继续转 接培养
繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等
优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。
血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。
血清的消毒：过滤除菌
其他细胞培养用液
水：新鲜的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液
超净工作台 高压蒸汽灭菌器 过滤除菌装置 倒置显微镜 水纯化装置 恒温培养箱 电热干燥箱 离心机、天平、水浴、摇床 液氮罐 冰箱：4℃、-20 ℃ 、-80 ℃
移液器 移液管 吸管 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 培养皿： 30、60、120毫米 多孔培养板： 4、6、24、96孔 离心管 冻存管