纳米生物学研究中的新技术*刘 丹 郭 振 王振兴 张 凝 姚雪彪(中国科学技术大学微尺度国家实验室,合肥230026)摘 要:大量的生物结构,从核酸,蛋白质,病毒到细胞器,其线度在1 100纳米之间,生物结构虽然很小,但异常复杂,又格外活跃,表现出很多特定的生物学功能,纳米生物学就是在纳米水平阐明生物分子作用规律的一门新兴学科,通过对生物大分子超微结构的解析和操纵,获得单个分子在生命活动中的详尽信息,从而在单分子水平上探寻影响人类健康的恶性疾病的发病机理,并最终能够利用对单分子进行微尺度操纵的技术进行治疗。
纳米生物学是一个非常有意义,但又神秘莫测的领域,但广阔的应用前景已经昭示了这一交叉学科强劲的生命力。
本文将着重介绍原子力显微镜和光镊在纳米生物学研究中的重要应用。
关键词:纳米生物学 单分子 生物大分子 微尺度The Latest Progresses in Nano biological Technology*LIU Dan GUO Zhen WANG Zhenxing ZHANG Ning YAO Xuebiao (Hefei National Laboratory for Physical Sciences at Microscale,University ofScience and Technology of China,Hefei230026)Abstract:Recent advancement in single molecule detection techniques enables us to visualize the dy namic behaviour and reaction kinetics of indiv idual biological molecules inside living cells.Single molecule visualiz ation p r ovides a direct w ay to quantif y,w ith a high sp atial and temporal resolu tion,biological events inside cells at the single molecule level.Nano biology is a new discipline that aims to elucidate the molecular f unction and r egulation of bio molecules at nano scale.I n this essay, we highlight r ecent p rogresses on single m olecule visualiz ation in cell biology.Key words:nano biology,single molecule,biological molecules,nano scale在纳米生物学研究技术中,原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)和光镊(optical tw eezers)应用最为广泛。
原子力显微镜是20世纪80年代问世的扫描探针显微镜的(scanning probe microscope,SPM)的一种。
它的放大倍数远远超过了常规的光学显微镜和电子显微镜镜,其极限达到了10亿倍,可以直接观察物质的分子和原子。
另外,AFM的样品制备非常容易,还可以在模拟生物学环境中使用,这些优势使它广泛应用于蛋白质大分子的拓扑学分析、多蛋白复合物结构解析等方面的研究。
在对AFM的针尖进行一些特殊的处理之后,它可以粘附生物大分子,从而使我们可以利用微*基金项目:本文部分实验由国家973项目(2002CB713700)及中科院知识创新工程(KSCX2 2 01)支持。
悬臂的形变来对其进行一系列的力学性质的测量。
光镊技术也是上个世纪80年代兴起的一种微观动力学测量技术。
它利用激光束形成的三维势阱控制微观物体的位置和移动,可以探测纳米级的位移以及皮牛级的相互作用力,广泛应用于马达蛋白运动以及RNA聚合酶工作原理等研究方向。
与AFM 相比,光镊系统对分子相互作用力的测量精细度更高,但会受限于激光器功率;原子力显微镜则不会遇到这方面的问题,并且凭借其操作简单方便的优势,可有效的弥补光镊系统的缺陷。
原子力显微镜与光镊技术的有机结合,可以在分子及原子水平剖析重要的生物大分子的结构 功能相关性,这将为详尽描绘生物大分子的功能奠定基础,同时还将极大地推动现有的分子细胞生物学研究的进展。
1 原子力显微镜(Atomic force mi croscopy)1 1 原子力显微镜简介AFM通常使用一集成在灵敏的微悬臂上的极细针尖(tip)对样品表面进行扫描。
整个过程中,有几种力同时作用于针尖,其中最重要的是范德华力。
当针尖与样品相互靠近时,它们将相互吸引,随着两者间距的缩小,相互间的电子排斥力将抵消引力,直到间距为几个埃时,二力达到平衡,间距更小时,范德华力由负变正(排斥力),利用此力的性质可使针尖与样品处于不同的间距,由此改变微悬臂与针尖的工作模式。
AFM主要的工作模式包括接触模式(contact mode)和轻敲模式(tapping mode)(图1A、B)。
接触模式时针尖原子与样品表面原子的电子云发生重叠,排斥力将占主导地位,扫描时针尖持续接触样品表面。
而在轻敲模式中,微悬臂以较大的振幅震荡(约100nm),扫描时针尖间歇地与样品表面接触。
轻敲模式可以减弱接触模式中的横向力,不易损坏样品表面,比较适用于观察柔软、粘连、易碎的样品。
AFM探针是其核心的部件,直接决定了它的空间分辨率。
探针针尖的表现主要依赖于其形状和尺寸。
传统探针针尖常由氮化硅制作,与微悬臂形成一体化的结构。
由于针尖一般为金字塔形,当样品尺寸大小与针尖尖端相当或更小时,会出现 放大效应(图1C、D),导致测量值大于真实值,影响图像的准确度。
而将单壁碳纳米管针尖粘附到传统针尖上可以有效地解决这个问题,碳纳米管具有很高的纵横比,并且具有很强的机械柔软性和弹性变形能力,可有效避免针尖的损坏,并可以减少对样品的伤害(图2)[1]。
微悬臂也是探针一个非常重要的组成部分,它直接决定了针尖的探测频率,选用超短的微悬臂[2],或者对其进行氧化锌镀膜的修饰可以有效提高扫描的速度[3],从而更加有利于对一些生化过程进行实时的扫描分析。
另外,微悬臂的弹性系数也直接决定了AFM的力学分辨率,在利用AFM对生物大分子进行力学测量时,选用合适的微悬臂可以起到事半功倍的效果。
图1 A说明了在接触模式下,tip对样品的扫描方式;B 说明了在轻敲模式下,tip对样品的扫描方式;C,D则说明了在tip的曲率半径不同的时候,实际得到的图像由于 针尖效应的存在与样品实际形状的差别图2 碳纳米管对扫描针尖的修饰。
(Adam T Woolley et al.)右上Scale bar=1um,右下scale bar=20nm1.2 AFM的应用1.2.1 生物大分子成像及拓扑学分析利用AFM的高分辨率对生物大分子的构像进行三维的动态分析是一种广泛应用的技术[4]。
相对于传统的晶体学方法,改种技术的优势在于操作简单,周期短,并且可以使生物大分子处于完全自然的溶液环境里,得到最符合体内环境下的构像。
利用这种方法观察生物大分子时,我们只需要将生物大分子溶液平铺于云母片上,利用氮气吹干,然后直接用AFM 进行观察,将获得的图片利用专业软件进行处理后,即可得到分子构像等信息;如果要获得生物大分子构像的实时变化信息,则需要利用液池,选用包含生物大分子的合适的溶液体系,利用高频率的扫描进行观察。
[3].在此研究方向上,我们已经获得了一些生物大分子数据,为我们进行更深入的生物化学及细胞生物学研究提供了有效的结构信息和证据(图3)。
图3 这是我们研究小组在研究过程中得到的蛋白质构像图。
给予了我们蛋白质大分子在天然情况下形态、大小的一些基础信息1.2.2 生物大分子力学性质分析及相互作用力研究利用AFM 测量生物大分子的机械力学性质是当今细胞分子生物学最活泼的一个研究方向。
很多的肌动蛋白结合蛋白都具有相似的结构域,包含有两个肌动蛋白结合区域,两个区域之间由一段可以伸缩折叠得rod 区域连接,Ingo 等人利用AFM 成功地检测并量化了肌动蛋白结合蛋白的rod 区域的机械动力学性质[5]。
对生物大分子相互作用力的研究对于揭示蛋白质复合物的组成形式及相互作用关系有着非常大的推动作用。
SNARE 是一个在胞吞胞吐过程中起着重要作用的蛋白质复合物,由SNAP25、VAM P2以及syntax in 1三个蛋白质相互结合而成。
对于它们结合方式的认识将有助于揭示SNARE 的组装机制以及工作原理。
A.Yersin 等人利用AFM 分别对这三个蛋白质两两之间以及其中一个与其余两个之间的相互作用力进行了测量,发现结合较强的syntaxin 1和SNAP25先形成一个小的复合物,然后VAMP2再结合上去形成SNARE 复合物[6]。
从已知的晶体学以及动力学证据来看,这个结论是完全正确的,上述研究成果展示了AFM在蛋白质复合物解析中可以获得其它技术无法得到的微尺度动力学信息,具有得天独厚的优势。
1.2.3 其他方面的应用除了上面重点介绍的2大方面以外,AFM 在研究细胞形态结构、细胞膜结构及物质交换,以及生化反应过程等方面也都有着广泛的应用,但对系统有更高的要求,并且还需要能够对样品进行复杂的修饰和操作。
2 光镊(optical tweezers)技术2 1 光镊技术简介1986年光镊问世以来,短短十余年间,光镊技术已从微米精度的探测与操控发展到了纳米精度的探测与操控。
技术上的这一跨越,集中表现在纳米精度的位置操控和纳米精度的位移测量上。
这一跨越的意义不仅仅是技术上迈入了一个新的高度,而且从光镊技术的实际应用来看,也因此有了质的变化,成为研究单个生物大分子在生命过程中行为的有效工具,一种重要的纳米生物学技术。
能否操控纳米量级的粒子是纳米光镊技术首先要解决的问题。
人们已经发展了多种方法来操控生物大分子,从而可以研究它们间的相互作用和运动特性。
现在最为常用的就是间接操控法,即采用光镊可以方便地进行操控的微米粒子作为所谓的 手柄 ,将生物分子粘附其上,光镊操控这样的 手柄 就相当于操控了生物分子,可作为 手柄 的微米粒子有很多,比较常见的如聚苯乙烯小球,生物学实验中常用的蛋白质A/G 小球等等。
无论是生物分子的识别还是生物分子的运动都必然牵涉到纳米量级精度的位置和位移的测定。
在纳米光镊技术中,生物大分子位移的测量是通过测量操控 手柄 !!!刚性微米小球的位移间接测量的。