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选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根） 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
配制SDS-PAGE凝胶
配制 12% 的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留 0.5cm 的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。 待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲 洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。
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Fig1 上下图分别为正常大鼠和失神经大鼠腓肠肌蛋白双向电泳 图谱，右图为左图方框内的局部放大图。
应用 Application
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双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用，可 用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、 蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、 致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。 目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而 双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物 医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白 质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶， 以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术 的发展，如液相２－ＤＥ，蛋白质芯片结合ＳＥＬＤＩ－ＭＳ技术的 应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊 断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病， 特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将 造福于人类。
两维间的平衡
• 等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电 泳，也可于－80°保存数月。
• 但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡， 以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合， 从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。
二维SDS-PAGE
• 同普通SDS-PAGE类似。
• 但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因 为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩， 可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺 胶）充当了浓缩胶。
• 考马斯亮兰染色
凝胶染色
• Bio-Safe染色
• 水洗3次，5min/
次。 • Bio-Safe染色1小
Bio-Safe染色 法
时。
• 水洗30min.
图像扫描及 软件分析
Isoelectric point
201
Molecular mass (kD) 120 100 56 38 30 20 7
pH 3-10
pH 3 - 6
pH 5 - 8
pH 7 - 10
pH 3- 6
pH 5- Narrow Range IEF
聚焦时间的优化
• 要获得高质量的图谱以及很好的试验重复性，所需的最佳 时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。 • 聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长 度通过经验来确定。 • 聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。 • 过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性 水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋 白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。
+
pH 3 pH 7.5 pH 10
–
+
pH 3 pH 7.5 pH10
SDSPAGE
电 泳
charge
– size
第 二 向：
双向电泳实验流程
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
胶条的平衡
冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。


吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。
操作
Method
双向电泳实验流程
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration） 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
样品制备基本原则：
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制 备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而 保证待研究蛋白的可检测性。
胶条的转移
SDS-PAGE电泳
在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电 泳槽中。
在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的
低电流（ 5mA/gel/7cm ），待样品在完全走出 IPG 胶条， 浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm）， 待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角 以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
不同样品的基本处理方法
可溶性样品 固体组织样品 细胞
样品的分级处理 通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀 等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样 品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单 有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不 同进行分离。
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标：
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
• 最高电压10,000 V • 10–25C 温度控制
• 7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚 焦盘，可以各放12根胶条
• 可以储存10个程序，每个程序有 10步 • 程序可进行时时编辑 • 可供选配的打印机
等电聚焦的 操作
等 电 聚 焦 程 序 的 设 置
7cm胶条
水化
S1 S2 S3 S4 250V 1000V 4000V 4000V 慢速 快速 线性 快速
12小时（17℃） 被动水化
30分钟 60分钟 3小时 24,000伏小时 ~28,000伏小时 除盐 除盐 升压 聚焦
S5
500V 保持
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全 破坏，从而形成各个多肽的溶解液； – 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和 核酸等物质的去除； – 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
• 溶解的手段：
离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质
Broad Range Separations
pH 3 - 10
中南大学湘雅医学院 精神卫生1201班 谓
吴所 方
• 蛋白质组（Proteome）：
在一种细胞内存在的全部蛋白质。
• 蛋白质组研究中主要应用的技术包括：
双向电泳(2-DE)、 新型质谱(MS)技术、 数据库设置与检索系统等。
原理
Theory
实验操 作
应用
Method
Application
第 一 向 ： 等 电 聚 焦