1.适用范围
本SOP适用于色谱类方法验证
2.参考标准/资料
3.检测方法的适用性验证内容
3.1专属性
a. 试剂空白实验：考察实验过程中所用试剂对目标物的干扰情况。

b. 干扰实验：当空白样品（样品不含目标物，其它基质一致）可获得时，直接进行空白实验（使用空白样品经过完整的样品前处理及分析过程），考察在目标物出峰时间有无干扰峰。

当没有空白样品情况下，对于液相色谱，目标物有紫外吸收时可采用DAD检测器验证峰的光谱特征是否与标准品一致；另可采用不同填料色谱柱、选择不同流动相、改变梯度洗脱等方法考察目标物的出峰变化情况；对于气相色谱，可采用不同填料色谱柱、选择不同载气、改变程序升温等方法考察目标物的出峰变化情况。

注：1. 专属性：是指在样品介质中有其它组份共存时，检测方法对目标物准确而专属的测定能力。

2. 如以上方法不能确定其专属性，可由其它分析方法予以补充，例如：质谱、旋光仪、核磁共振等方法。

3. 应附代表性图谱，以说明方法的专属性，并应标明目标物在图中的位置，色谱法中的分离度应符合R s≧1.0要求（一般来说R s<1.0，两峰总有部分重叠；当R s=1.0，两峰能明显分离；当R s=1.5，两峰已完全分离；摘自《仪器分析》武汉大学化学系编，高等教育出版社2001版）。

R s=2(t2-t1)/(Y1+Y2)；t：色谱峰保留时间；Y：峰底宽。

3.2校准曲线
a. 对于含量<0.01%的痕量成分分析，样品中目标物含量一般比较低，标曲浓度范围应包含检测限及尽可能覆盖一个数量级，但不宜过宽，一般为1-2个数量级，至少作5个点（不包括空白）。

b. 对于含量>0.01%的常量与微量成分分析，可根据方法定量限和实际样品含量选择标曲浓度范围，标曲浓度范围尽可能覆盖一个数量级，但不宜过宽，一般为1-2个数量级，至少作5个点（不包括空白）。

c. 应描述校准曲线的数学方程，相关系数不应低于0.99。

注：1. 在分析化学中，根据分析试样中待测成分的含量多少，分析化学可以分为：
常量成分分析（质量分数>1%）、微量成分（0.01%~1%）分析和痕量成分分析（<0.01%）；摘自《分析化学》武汉大学主编，高等教育出版社2000年第四版）。

2. 确定测试样品中被测成分浓度应在校准曲线的线性范围内。

3. 标曲中每个浓度水平分置在3个进样瓶中，分别进样，结果取平均值。

4. 应附相关图谱。

3.3 检出限与定量限
a.（首选）信噪比法：把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

一般以信噪比为2:1/3:1时相应浓度确定检测限，信噪比为10:1时相应浓度确定量限。

b.（可选）空白值标准偏差法：
C L=（2或3）S b/b
式中：C L-方法的检出限
S b-空白值标准偏差（一般平行测定20次得到）
b-方法校准曲线的斜率
对于定量限一般为检出限的3倍。

注：1. 检出限:被测物能被检测出的最小值。

2. 定量限:被测物能被准确测定的最小量，其测定结果应具有一定准确度和精密度。

3. 无论用哪种方法，均需制备相应检出限浓度的样品，反复测试进行确定。

4. 检测方法SOP编写时应将仪器检出限和定量限换算为方法检出限和定量限。

5.应附相关图谱。

3.4 准确度（回收率）
a. 对于含量<0.01%的痕量成分分析，样品中目标物含量一般比较低，回收率应在方法检出限、三倍方法检出限、十倍方法检出限进行三个水平实验，每个水平测定次数至少为3次。

回收率要求参考范围见表1。

b. 对于含量>0.01%的常量与微量成分分析，可在定量限附近和根据实际样品含量选择合适点进行三水平（高、中、低）实验，每个水平测定次数至少为3次。

回收率要求参考范围见表2。

注：1. 准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值的接近程度，一般以回收率（%）表示。

2. 对于样品基质或前处理特别复杂的实验，回收率要求可根据条件适当放宽。

3. 标准品与样品应混合均匀，所有加标样品必须经过完整的前处理过程。

4. 回收率实验一般有两种方式。

在空白样品可获得的情况下，通过在空白样品中加入已知量A的标准对照品，进行回收试验，其回收率可表示为：
R=(M-空白)/A*100%
式中：R：回收率（%）
M：试验测定值
A：加入已知标准品的量
在空白样品不可获得，但可以得到已知量的真实样品时（样品含量应尽量接近或小于检出限，否则会影响加标实验），可通过在真实样品中加入已知量A的标准对照品，进行回收试验，其回收率可表示为：
R=(M-P)/A*100%
式中：R：回收率（%）
M：真实样品中加入标准对照品后试验测定值
P：真实样品的试验测定值
A：加入已知标准品的量
5. 标准品与样品充分混合均匀时，可配制不同水平（高、中、低）加标样品各一个。

针对同一个加标样，重复取样检测6次，可同时考察本浓度水平的回收率与精密度情况。

6. 应附相关图谱。

3.5 精确度（重复性）
a. 根据实际样品含量选择一合适点（一般取实际样品含量范围的中间值）进行考察，重复测定次数至少为6次。

实验室内部重复性考察的相对标准偏差参考范围见表3。

b．（根据实际情况选作）重复性限r：根据实际样品检测需求选择一（一般取含量范围的中间值附近）或多个浓度水平进行考察，每个浓度水平重复测定次数建议为20次，对应的重复性限r=2.8σ, σ为标准差。

c.（根据实际情况选作）中间精密度：根据实际样品检测需求选择一（一般取含量范围的中间值附近）或多个浓度水平进行考察。

要求不同的分析人员采用相同的分析方法、在不同的时间、使用不同的仪器进行测试，以确认方法的适用性。

注：1. 精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀的样品，经过多次取样测定所得结果之间的接近程度，即一组测量值彼此符合的程度，一般用相对标准偏差表示。

2. 重复性限是一个数值，在重复性条件下，两个测试结果的绝对差小于或等于此数的概率为95%。

3.中间精密度：在一定测量条件下的测量精密度，这些条件包括相同的测量程序、相同地点并且对相同的样品在一长时间段内重复测量，但可包含其它相关条件的改变（如设备系统、操作者和环境条件等变量）。

4. 有的样品含量范围比较宽，考察一个浓度点的重复性代表性不够，可选择在方法检出限和常见样品浓度之间选择高、中、低三水平进行重复性考察，每个水平重复测定次数至少为6次。

5. 本SOP对重现性及重现性限等暂不作要求。

6. 应附相关图谱。

3.6系统适用性
系统适用性试验主要是考察试验系统的可行性，对于色谱类，一般为柱效、重复性、专属性。

即包含塔板数、分离度、拖尾因子、RSD等。

注：1. 应附相关图谱。

3.7耐用性
a. 典型影响耐用性的变动因素包括：被测溶液的稳定性、样品的提取次数、时间等。

液相色谱法(HPLC)中的典型的变动因素包括：流动相的组成和pH值、不同品牌或不同批号的同类型色谱柱、柱温、流速等。

b. 溶液的稳定性考察：用来证明根据相应方法制备的样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在一定时间内保持稳定。

例如：依据方法配制样品溶液和标准品溶液，在室温或其他条件下（如冰箱2-8℃）条件下储存适当的时间。

每个间隔点，用新鲜配制的标准品溶液做对照，测定储存的样品溶液和标准品溶液。

测定结果与初始结果进行比较，结果接近一致时便可确认样品溶液和标准品溶液在规定的储存条件下在规定储存时间是稳定的。

注：1. 耐用性：测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。

2. 经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。

如果通过耐用性研究发现分析方法对某个或某些测试条件敏感或要求苛刻，应在方法中予以写明。

3. 可根据实验具体情况选择考察耐用性的内容。

4. 应附相关图谱。