国家重点基础研究发展计划（973计划）课题年度总结报告项目编号：2007CB714300项目名称：工业生物技术的过程科学基础研究项目负责人：谭天伟课题编号：2007CB714303课题名称：生化反应过程放大原理与方法课题承担单位：华东理工大学课题负责人：庄英萍中华人民共和国科学技术部制2008 年 12 月 6 日填写说明1、统一用A4复印纸；2、封面用白色厚纸，请勿用塑料封皮；3、内容要双面印刷；4、按照给定格式编写，文字叙述部分用小4号仿宋字；5、各项内容要实事求是、认真填写，文字叙述简明扼要、层次分明，一页不够可续页；6、请认真阅读格式后面的编写说明，按规定编写；7、要注意相关数据的一致性和平衡关系。
（限5000字左右）一、研究工作的主要进展（计划任务完成情况、预期目标是否实现、所取得的突出进展等）本课题研究的目标是建立适合生物过程的新型放大方法和模型，即利用生物学和工程学的原理，对生化反应过程开展科学问题研究，形成反映生物反应特性和反应器传递特性的直接放大理论，最终用于指导主要工业生物技术产品如有机醇、有机酸等大规模发酵过程，突破传统“实验室－小试－中试－工业”逐级放大的思路与方法，实现工业发酵过程的定量设计与直接放大。
课题组根据原定目标开展了下述研究，达到了原定的阶段性目标，并取得了一些突出进展。
课题组根据原定的科学问题研究思路，突破了原有仅从生理调控等单一机制进行工业生物过程研究的局限性，建立了生物反应器的生物学与工程学研究相结合的理论与方法，也即提出了在工业生物反应过程中存在着由细胞基因、代谢尺度所决定的细胞生理代谢特性和由反应器多相流混合系统所决定的环境特性，而本课题在生物学方面则是通过多尺度参数相关分析方法实现了细胞生理代谢特性的研究，在工程学方面通过利用计算流体力学方法实现了反应器流场特性的研究，最终使生物和工程实现了有机结合，即工程操作满足了细胞代谢的需求，实现了跨尺度动态观察与分析，实现了工业生物过程的优化与放大。
课题组在研究过程中围绕三个科学问题开展了相关研究：1、多尺度工艺优化原理研究与方法的建立：通过研究各类生物过程在线检测的传感器以及用于海量生物过程信息处理的系统建立，获取了表征生化反应过程特征参数变化趋势，更好地认识了过程；2、细胞生理代谢与流场特性相关原理研究与分析方法建立：通过应用生物过程参数相关分析原理，获得放大过程中细胞代谢特性敏感关键参数，应用工程学原理与方法对实际工业生物过程环境特性的反应器流场特性开展研究，并建立细胞生理代谢特性和反应器流场特性的相关分析方法；3、工业生物过程放大应用理论研究：在工业生物过程中强化反应器流场特性与细胞代谢特性的协调与优化，实现了反应器流场特性与细胞生理代谢特性相结合放大策略。
课题研究过程中取得了多项学术成果：一是在头孢菌素C发酵过程放大研究中首先发现了细胞宏观代谢流特征参数呼吸商（RQ）在小试50L发酵罐和工业规模160 m3发酵罐上的差异，并通过相关分析，发现了大型工业发酵罐中，后期流加的基质----油的利用程度大大低于小试发酵罐；与此同时，通过计算流体力学对工业规模发酵罐的流场特性研究表明：由于反应器中搅拌形式的不合理而导致反应器的混合特性差，基质在工业规模罐中的分布存在浓度梯度，影响了细胞对基质利用，导致基质利用率低、发酵单位低；在找到问题症结后及时调整了发酵设备，改善了反应器的混合问题，提高了基质的利用程度，使发酵单位提高20%；二是在红霉素发酵过程研究中，通过50L小试发酵罐、120吨和370吨工业规模发酵罐的同步研究，并在发酵容积从120吨放大到380吨时，利用计算流体力学方法对反应器的流场特性进行了研究，并采取了对16米高的反应器多点、多参数的检测与校验，证明反应器的混合特性利于红霉素发酵过程，在研究过程中发现基于细胞宏观代谢特征参数氧消耗速率OUR的前期调控是过程优化与放大的关键，实现了宏观代谢流参数如OUR、CER等的趋势一致，实现了从120吨到380吨放大研究，红霉素发酵单位提高30%以上，三年新增利税2.5亿多元，实现了大宗发酵产品清洁生产，发挥节能降耗减排的重大作用；三是利用上述放大原理，在克拉维酸和维生素B12等产品中，分别实现了从50L向60吨和120吨发酵罐的放大，而发酵单位分别提高了30%和100%以上；四是课题组进一步建立和完善了下述工业生物技术产品过程优化研究中的技术平台建设：新型生物过程在位检测技术与方法，如发酵过程在线尾气质谱仪的应用、具有国际首创的原位细胞形态观察仪的研制与应用、用于厌氧发酵过程的氧化还原电位电极的应用研究等，为更好地实施工业生物过程的实时优化奠定了坚实的基础；将前沿生物技术的最新进展应用于工业生物过程的过程研究中，如在阿维菌素工业发酵过程中开展了转录组学、蛋白质组学应用研究，为工业发酵过程调控又提供了新的视角；生物过程在线数据处理网络系统与数据库的建立，为实现工业发酵过程的异地远程专家实时诊断奠定了物质基础；另外在多个工业生物技术品种中的开发出了各种新型优化技术，如丙酮酸发酵过程中基于代谢工程控制的原理，建立了多项过程调控的新方法，实现了过程的优化研究，使产品的发酵单位有了大幅度的提高。
在完成了上述科学问题的创新研究和实践的同时，课题组在一年多的时间里有三个项目完成了科技成果鉴定，其中“现代生物技术与先进工程放大技术相结合的千吨级红霉素发酵生产新工艺”（鉴字[教SW2008] 第 011 号）项目目前已初评为2008年度上海市科技进步一等奖（进入公示阶段）；课题组在项目完成期间获得授权发明专利4项，申请发明专利18项，其中“一种可用于多参数相关分析的新型生化反应器”申请了PTC专利，而围绕工业生物过程的放大申请了三项专利；在项目实施过程中，课题组发表了SCI论文11篇，“ATP in Current Biotechnology: Regulation, Application and Perspectives”发表在“Biotechnology Advance(IF 5.236)”，其中有关红霉素大规模发酵过程研究的论文“Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50-l to 372-m3 scale”和维生素B12大规模发酵过程研究论文“Improvedlarge-scale production of vitamin B12 by Pseudomonas denitrificans with betaine feeding”发表在本领域有影响的杂志“Bioresource Technology（IF3.103）”，另一篇有关产氨短杆菌乳清酸磷酸核糖转移酶的研究论文“Orotate Phosphoribosyltransferase from Corynebacterium ammoniagenes Lacking a Conserved Lysine”发表在“Journal of Bacteriology (IF4.013)”。
重要项目简介：项目名称：先进技术集成的红霉素生产新工艺获奖情况：2008年上海市科技进步一等奖（公示中）第一完成单位：华东理工大学以红霉素A为原料合成的第二、三代红霉素及其衍生物临床应用的扩大，已引起医药市场的注意。
高吨位发酵罐的红霉素发酵水平、有效组分含量、过程高效节能和绿色生产就成为我国参与红霉素类产品国际市场竞争的关键因素。
项目围绕实现工业生产菌株的代谢工程改造，优化发酵液组分；以宏观代谢流分析与控制为核心实现发酵过程优化研究；实现了生理代谢特性和反应器流场特性相结合的发酵过程放大；建立膜分离和结晶技术相结合的提取技术，实现了红霉素节能减排的清洁生产工艺技术等四个方面突破。
项目创新点：(1)实现红霉素工业生产菌株代谢工程改造，使发酵液中红霉素有效组分A比例明显增加；(2)建立基于多尺度参数相关分析的红霉素发酵过程发酵过程动态优化与放大方法，大幅提高工业规模发酵水平和发酵指数；(3)提出反应器流场特性与菌体生理特性研究结合的放大原理，成功实现370m3发酵罐工程放大；(4)建立工业生产规模微滤、纳滤组合膜分离技术,实现节能、降耗、减排生产新工艺。
主要技术性能和经济指标：工业生产规模红霉素发酵单位最高达1万U/ml，平均8000 U/m1以上，发酵指数从0.27提高到0.36，并成功在372m3发酵罐实现放大。
产品质量硫氰酸红霉素A组分含量达到80%以上，杂质B+C组分含量小于3%，采用组合膜分离技术清洁生产工艺后，实现了节能、减排，达到国际先进水平。
红霉素生产新工艺在生产企业推广过程中，由于技术不断进步和规模扩大，产量逐年大幅增长，三年累计生产硫氰酸红霉素2508吨，红霉素碱84.96吨。
与国内外相关技术比较：本项目以多种最新研究与生产技术对传统的红霉素工业发酵生产进行技术改造，在工业用菌株的代谢工程改造、发酵过程的多尺度优化技术和基于细胞代谢特性和流场特性相结合的放大方法、先进的分离纯化等三个关键研究技术上具有国际先进性，并拥有自主知识产权；产品生产质量、降耗、减排也处于国内先进水平。
应用情况：宜都东阳光生化制药有限公司从2004年试生产至今，总发酵容积已超过6000 m3，年产已达1700吨，为国内最大的红霉素发酵工厂之一。
有关原料药生产线已取得欧洲通用的GMP证书和美国FDA论证，产品已获得国际知名制药企业高度认同。
经济效益和社会效益：由于技术不断进步和规模扩大，产量逐年大幅增长，三年累计新增产值7.5亿元以上，新增利润2.2亿元，新增税收3900万元以上，创收外汇1758万美元。
本项目在工业发酵过程中形成的各种关键平台技术可为我国抗生素等发酵行业技术进步提供借鉴。
二、与国内外同类研究工作相比的创新性本课题组提出的多尺度工业生物过程优化理论及参数相关分析方法和以生物反应器流场特性与多尺度参数相关研究相结合的原理及发酵过程放大技术均处于国际同类研究的领先地位，具有创新性。
长期来国内外在工业生物过程优化研究时大多针对细胞外的反应器操作条件进行优化，随着生物技术的发展，对细胞内产物形成的机理越来越清楚，但与发酵过程整体优化相结合研究时，由于基于单一生理调控机制出发的研究往往只揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，仅靠高度分支化和具体分散的研究是难以对整个发酵过程优化控制和放大起决定性作用。
本课题研究人员提出的生物反应器中多尺度参数相关的理论方法，并先后在多项发酵产品上较好地解决了上述研究技术难点。
而本课题在原有的原理认识和技术上又有了新的发展：如对工业生物过程实时传感技术的研制，为实现多尺度发酵优化奠定了更坚实的基础：其中研制的应用于工业生物过程的在线显微细胞形态观察仪属国际首创；对工业发酵过程开展基因组学和蛋白组学研究，对认识生物过程的本质原理奠定了坚实基础，也属国际先进行列。