文章编号:042727104(2008)0320301205收稿日期:2007207213作者简介:尹　隽(1969—),女,讲师;通讯联系人钟　江,男,教授,E 2mail:jzhong@.Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV 的复制尹　隽,胡志鹏,宋大新,钟　江(复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系,上海200433)摘　要:从Tn5转座子介导的AcMNPV 随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP 2P95in.PCR 确认p95基因中插入了Tn5转座子;Westernblot 也证实A 2cApra41和AcGFP 2P95in 感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95ku 变为55ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的.关键词:杆状病毒;突变体;复制;基因表达中图分类号:Q812 文献标识码:A 杆状病毒(Baculoviridae )是一类主要感染节肢动物的病毒,基因组为双链环状DNA,大小约为80～180kb [1].一方面它们作为基因表达载体已被广泛地用于生产各种蛋白质,另一方面它们也可以作为生物杀虫剂使用.在所有的杆状病毒中,苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Auto gra pha cali fornica multiplenucle 2opolyhedrovirus,AcMNPV )是被研究得最为深入的一种病毒,该种病毒的基因组大小为133894b p,包括156个潜在的阅读框[2].尽管有一些基因已经被研究得很清楚,比如病毒的结构蛋白,必需的顺式作用因子等[327],但还是有许多基因的功能尚不清楚.为了能高效地研究这些未知基因,我们用Tn5转座子介导的随机插入突变法构建了AcMNPV 突变库(李惠等[8],尹隽等,待发表).本文研究了从突变体库中筛选到的一株p95基因带有插入突变的突变体.研究结果提示完整的P95蛋白对病毒在细胞中的复制是非必须的.1　材料和方法1.1　细胞、病毒和菌株草地贪夜蛾细胞系Sf9细胞用TNM 2FH 培养基(Sigma 2Aldrich,MO,USA)补充10%的小牛血清、100U/mL 青霉素和100U/mL 链霉素培养.带有AcMNPV 基因组的质粒(bacmid )来源于Bac 2to 2Bac 系统(Invitro gen,CA,USA ),保存于大肠杆菌中,它转染Sf9细胞后可以复制产生感染性的AcMNPV [9].以在病毒多角体启动子下游插入绿色荧光蛋白基因(gfp )的bacmid (bacGFP )作为起始病毒基因组,利用体外转座系统构建了AcMNPV 随机插入突变体库(尹隽,发表中). E.coli BJ5183(RecA +)作为重组用菌株,E.coli EC100(Epicentre,WI,USA)用于保存bacmid.用于培养含bacmid 菌株的抗生素浓度分别为:卡那霉素(Kan )50m g/mL,庆大霉素(Gen )7m g/mL,阿普拉霉素(Apra )20m g/mL.1.2　Tn5转座子插入定位参见李惠等[8],简单介绍如下.根据AcMNPV 基因组序列,全基因组每隔1.5kb 沿同一方向设计了88个引物(分别命名为v1～v88,具体序列略).在转座子上设计两个引物Tn 2u p (5′2GTCTCCGACCT 2第47卷　第3期2008年6月复旦学报(自然科学版)JournalofFudanUniversit y (NaturalScience )Vol.47No.3Jun.2008GATG 2CAGCTC 23′)和Tn 2down (5′2ACGACTACGCACTAGCCAACA 23′)(图1).用v1～v88分别和Tn 2up,Tn 2down 组对作为引物,以突变体bacmidDNA 作为模板进行PCR 扩增,结果v45和Tn 2down 得到阳性PCR 产物.产物割胶回收后进行DNA 序列分析(上海英俊生物技术公司),得到转座子插入位置的上游一侧的序列.在距离上游插入位点约500b p 处再设计一个引物p95down (5′2CGGCGTCGGTCGTTTGAA 23′),以p95down 和Tn 2up 作为引物再进行PCR,得到的产物同样测序,得到转座子插入位置下游一侧的序列(图1).图1　转座子插入位置及引物示意图Fig.1　Diagramofthelocusoftrans posoninsertionandsitesof primersOrf 81,Ac 2TLP ,p 95:AcMNPV 编码基因;hr3:AcMNPV 基因组同源序列3,Tn5:Tn5转座子;A pra :阿普拉霉素基因;v45,p95up,p95down,Tn 2up,Tn 2down:实验中所用引物的位置和方向.数字代表在AcMNPV 上的相对位置1.3　定向重组构建bacGFP 2P95in 重组病毒在距离p95down 上游1kb 处设计引物p95up (5′2CTGATAACGTGCATCAACCG 23′)(图1),以bacmidDNA 为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增,得到2.6kb 的片段,包括1.6kb 转座子序列和位于转座子序列两侧各0.5kb 的基因组序列.将该片段转化带有bacGFP 的大肠杆菌BJ5183菌株(BJ51832bacGFP ),让片段与bacGFP 发生同源重组.由于片段中的转座子序列含有Apra 抗性基因及启动子,用Kan/Gen/A pra 抗性平板筛选得到的就是同源重组后的bacmid 重组子.抽提重组bacmidDNA,以之为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR,并对扩增产物进行电泳检测.如果能得到2.6kb 产物,即为转座子插入p95基因的正确克隆.取同源重组bacmidDNA 电转化 E.coli EC100感受态细胞,得到的同源重组bacmid 命名为bacGFP 2P95in.抽提bacGFP 2P95inDNA,用Cellfectin (Invitro gen )转染Sf9细胞,得到重组病毒AcGFP 2P95in.同样以bacGFP 转染Sf9细胞,得到对照病毒AcGFP.1.4　重组病毒AcGFP 2P95in 的鉴定为了确定重组病毒的正确性,分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 病毒感染Sf9细胞(感染复数MOI=5pfu/cell ),3d 后收取上清,分别抽取病毒基因组DNA.500μL 抽提液(20%PEG80001.6mol/LNaCl )与500μL 病毒上清混合,室温放置30min 后,15000r/min 离心15min.沉淀用20μLddH 2O 溶解后,加入80μL 裂解液(10mmol/LTrispH8.0,10mmol/LEDTA,20m g/mLRNaseA,0.25%SDS,80μg 蛋白酶K ).50℃反应1h 后,用等体积酚抽提.水相加入1/10体积3mol/LNaAc 及2倍体积的无水乙醇沉淀,即得到子代病毒的基因组DNA.以此为模板,p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增:94℃30s,58℃30s,72℃150s,共30个循环.1.5　Westernblot 检测P95蛋白在Sf9细胞中的表达24孔板中每孔接种大约2×105个细胞,同时加入适量病毒液使MOI 约为5pfu/cell.27℃培养72h 后,将贴壁细胞吹打下来,5000r/min 离心5min,沉淀用1×PBS 漂洗后,加入40μL2×SDS 样品缓冲液,进行SDS 2PAGE (10%)电泳分析和Westernblot 检测.一抗为用原核pET 系统表达的P95蛋白自制的鼠抗P95抗体(稀释倍数为1∶500),二抗为碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG 抗体(Sigma 公司,稀释比例为1∶30000).以BCIP/NBT 为底物,进行显色反应.203 复旦学报(自然科学版)第47卷　1.6　重组病毒AcGFP 2P95in 生长曲线测定以MOI=5分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 感染Sf9细胞,在不同的时间取上清,按标准方法测TCID50[10].2　结　果2.1　Apra41筛选和转座子在基因组中的定位从一个Tn5介导的杆状病毒随机插入突变体库中,抽提bacmidDNA 转染Sf9细胞,从中挑选出一株复制完全正常的突变体病毒AcApra41.该突变体能在细胞中产生明显的细胞病理效应,能形成子代病毒,且其极晚期启动子能启动报道基因gfp 的表达.通过对全基因组进行PCR 扩增,确定转座子插入位置(参见李惠等[8]),发现引物v45和Tn 2down 配对进行PCR 扩增可以得到1.3kb 的阳性条带,表明转座子反向插入病毒p95基因的编码区.测序结果证实转座子上游插在p95基因编码区的69304位点.在距离69304下游约500b p 处设计引物p95down,用p95down 和Tn 2up 进行PCR,得到0.5kb 产物,测序结果表明转座子下游与病毒基因组的交界在p95基因编码区的69294位点(图1).转座子插入造成11b p 的正向重复,破坏了p95基因的编码序列.2.2　定向重组构建转座子插入p95的重组病毒为了排除AcApra41中除了p95位点转座子插入外还有其他突变的可能性,用同源重组法构建了p95位点定向突变的bacmidbacGFP 2P95in,转染Sf9细胞得到重组病毒AcGFP 2P95in.同样用bacGFP 转染Sf9细胞得到对照病毒AcGFP.抽提AcGFP 2P95in 和AcGFP 感染细胞后产生的子代病毒DNA,通过PCR 验证定向重组病毒的正确性,结果如图2所示.以p95up 和p95down 为引物进行PCR 扩增时,AcGFP 产生1.0kb 片段,而AcGFP 2P95in 产生一个2.6kb 的片段(图2),表明有1.6kb 的转座子插入.这些与预期完全一致.以p95up 和Tn 2down,及p95down 和Tn 2up 引物对进行PCR 扩增,仅AcGFP 2P95in 可以得到约0.7kb 的产物(图2),而AcGFP 没有产物,这些也与预期结果完全一致.为了进一步检验突变体病毒p95基因被破坏.用抗P95蛋白N 端的抗体检测AcGFP,AcGFP 2P95in 和AcApra41感染的Sf9细胞中P95蛋白的表达,发现AcGFP 感染的细胞中有一条95ku的条带(图3).AcGFP 2P95in 和AcApra41感染的细胞中缺少该条带,但均有一条约55ku 的条带,表明P95蛋白由于转座子的插入而截断了(图3).图2　PCR 检验定向重组病毒AcGFP 2P95inFig.2　ConfirmationofrecombinantvirusAcGFP2P95inwithtar getedinsertionofTn5图3　病毒感染Sf9细胞中P95蛋白的Westernblot 检测Fig.3　Westernblotanal ysisofP95proteininSf9cells infectedb yrecombinantviruses 2.3　AcGFP 2P95in 在Sf9细胞中的复制分别用AcGFP 和AcGFP 2P95in 感染Sf9细胞,MOI=5.测定感染5,24,48和72h 后培养上清中的病毒效价,并用荧光显微镜(Nikon,FX35A )观察感染72h 后细胞表达GFP 的情况.结果表明,AcGFP 2303　第3期尹　隽等:Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV 的复制 P95in 与AcGFP 有类似的病毒生长曲线(图4),且两株病毒由极晚期多角体启动子表达外源基因的水平也相当(图5).表明转座子插入p95基因并未造成AcGFP 2P95in 病毒的复制和基因表达发生明显的变化.图4　病毒感染细胞后胞外病毒增长的动态Fig.4　ThekineticsofextracellularvirustitreincellsinfectedbyAcGFP 2P95inandAcGFP 图5　AcGFP 2P95in 和AcGFP 表达绿色荧光蛋白基因的比较(200×)Fig.5　ComparisonofGFPex pressioninvirusinfectedcells byfluorescentmicrosco py左图:亮场显微镜;右图:荧光显微镜(200×)3　讨　论本研究从Tn5转座子随机插入杆状病毒突变库中分离到一个复制正常的突变体病毒AcApra41,确定该突变体中转座子位于病毒基因组69294～69304b p 处,破坏了p95基因的完整性.为了确保重组病毒的表型是由转座子的插入引起的,应用同源重组的方法构建了定向重组病毒AcGFP 2P95in.生长曲线测定表明重组病毒的复制状况与对照病毒类似,报告基因GFP 的表达也一致,说明p95基因的完整性对病毒复制并不是必须的.AcMNPV p95基因编码一个由846个氨基酸组成的蛋白质,理论分子量为95ku.该基因的同源基因在BmNPV,O pMNPV 等多种杆状病毒中都有编码[11212].实验表明该蛋白是病毒核衣壳的结构蛋白[2,12].同源性分析表明该蛋白还带有几丁质结合域,但它们与蛋白功能的关系还不清楚.本研究得到的p95基因插入突变的突变体,插入位置位于基因中间偏后位置,插入后破坏该基因,可以编码产生一个截短型P95蛋白.用抗P95蛋白N 端序列的抗体进行Westernblot 证实P95蛋白确实由野生型的95ku 变为一个约55ku 的蛋白.试验结果表明,转座子的插入并不影响病毒的正常复制和基因表达,这有三种可能:1)P95虽然是组成病毒粒子的结构蛋白,但对病毒的结构和在细胞中的复制并不是必须的;2)P95蛋白对病毒复制是必须的,但其N 端的序列已经能够发挥作用,不需要C 端的序列;3)P95的C 端序列对病毒复制也是必须的,在感染的细胞中它也能由某未知启动子驱动表达,但由于West 2ernblot 所用的抗体是针对N 端序列的,故无法检测到.虽然本研究的结果提示前两个可能性更大,但由于C 端尚有一段1.1kb 的长序列,目前尚不能完全排除第三种可能性.有研究表明BmNPV p95基因能转录出大小不同的两个mRNA [11],预示AcMNPVP95基因也可能存在这种情况.参考文献:[1]　Theilmann DA,BlissardGW,BonningB,et al .Baculoviridae[C]//Fau 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g(Department of Microbiolo gy and Microbial Engineerin g,School of Li fe Sciences,Fudan Universit y,Shan ghai200433,China)Abstract:Are plication2competentmutantvirus,AcA pra41,wasisolatedfromalibrar yofAcMNPVrandominsertional mutantsconstructedwithTn5trans posonmediatedmuta genesis.TheTn5trans posonwasdeterminedtobelocatedinthep95geneofAcMNPV genome.Toexcludethe possibilitythatAcA pra41containedothermutations,arecombinantvirus, AcGFP2P95in,whichhadtar getedinsertionofTn5in p95geneinexactl ythesamewa yasinAcA pra41,wasconstructed byhomolo gousrecombination.TheinsertionofTn5trans posonwasconfirmedwithPCR.Theinsertionoftrans posonre2 sultedinthea ppearanceofatruncatedformofP95proteinof55kuincellsinfectedwithAcGFP2P95inasshownb y Westernblotusin gantibod ya gainsttheN2terminal partofP95protein,incontrastwiththefulllen gthP95proteinof95 kuincellsinfectedwithwildt ypevirus.Virusre plicationcurveandfluorescentmicrosco picobservationindicatedthat AcGFP2P95inre plicatedandex pressedviral genesnormall yaswildt ypevirusinSf9cells.Theresultsindicatedthatafull2 lengthP95proteinwasnotessentialforvirusre plication.Ke ywords:Baculovirus;mutants;re plication;geneex pression 503　第3期尹　隽等:Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV的复制 。