第27卷第4期2010年8月生物医学工程学杂志Journal of Biomedical Engineer ingVol.27No.4August2010 EV71疫苗的研究进展*李明1,2尹怡1,2综述李晋涛2$审校1(第三军医大学学员旅,重庆400038)2(第三军医大学全军免疫学研究所,重庆400038)摘要:EV71引起的手足口病(H FM D)已经严重威胁婴幼儿的健康,但目前仍无特效抗病毒药物问世。

许多科技工作者正在研发各种类型的EV71疫苗,包括灭活疫苗、类病毒颗粒疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗及转基因口服疫苗。

本文就EV71疫苗的研究进展做一简要综述并对各自优劣和发展前景进行讨论。

关键词:手足口病;EV71;疫苗中图分类号R512.5文献标识码A文章编号100125515(2010)0420933204An Overview of the Evolution of EV71VaccineLi Ming1,2Yin Yi1,2Li Jintao21(Student Brigad e,T hird Military Med ical University,Chongqin g400038,China)2(I nstitution of I mmunolog y,PLA,Thir d Military Med ical University,Chongqing400038,Ch ina)Abstr act:EV71infection has become a ser ious public healt h threat especially among young childr en.Yet,at pr esent, no specific antiviral drug against EV71infection is available.A number of scientists are st udying various kinds of vaccines,including inactivated vaccine,virus2like par ticle vaccine,DNA vaccine,synthetic pept ide vaccines,and transgenic or al vaccine.T his article reviews the recent advancement in t he design of va rious kinds of vaccine aga inst EV71as well as their prospect ive usefulness,effectiveness,weakness and developments in the for egr ound.Key words:H and2foot2mouth disease(HF MD);Enterovir us71(EV71);Vaccine引言手足口病(hand2foot2mouth disease,H FMD)是一种临床表现为手、足、口腔等部位的疱疹及中枢神经系统并发症的婴幼儿疾病。

近年来,引起H FMD 的主要病原体为肠道病毒71型(EV71)[1]。

EV71属于小RNA病毒科,由单链RNA和衣壳蛋白VP12VP4构成,目前已发现其两种受体:人类清道夫受体B2(SCARB2)和P选择素的糖蛋白配体1 (PSGL21)[1]。

自1969年EV71在加利福尼亚H FMD中首次被报道后[2],EV71已在世界范围内引起十余次爆发和流行,且死亡病例趋于增多[3,4]。

最近在亚太地区的流行也呈上升趋势,1998年我国台湾的EV71大爆发,有129000例病例,重症病例多达400例,死亡78例[5]。

随后,在山东、北京、上*国家自然科学基金资助项目(30400402,30571708);国家科技支撑计划资助项目(2006BAI03B12)$通讯作者。

E2mail:ljtqm s@yah 海等多个城市相继有疫情的报道,其中2008年全国就有488955人被感染,126人死亡[6,7]。

EV71引起的H FMD给人类特别是婴儿健康造成了巨大的威胁,但目前仍无特效抗病毒药物问世,科技工作者主要致力于各种EV71疫苗的研究,本文拟将基于EV71的疫苗研究及其存在问题做一简要综述,以期把握其研究脉搏。

1灭活疫苗灭活疫苗是用物理、化学方法杀死病原体,但仍保持其免疫原性的一种生物制剂。

最早的EV71灭活疫苗被发展用以应对1975年保加利亚的H FMD 流行[8]。

但之后一直没有被使用和继续深入研究,因此没有数据证明其有效性。

直到1998年台湾H FMD疫情流行后,灭活疫苗再度被研究。

Wu 等[9]用灭活EV71疫苗、重组VP1蛋白、DNA疫苗分别免疫接种实验母鼠,并比较其新生小鼠对野生型EV71的免疫保护效果。

结果显示三种疫苗都提生物医学工程学杂志第27卷供一定的保护效率,但相比而言,福尔马林灭活的EV71疫苗的免疫保护效果最好。

尽管如此,EV71病毒分型众多,需要挑选免疫原性好、抗原谱广的毒株作为疫苗株,并建立一个适合的细胞培养系统满足大量灭活疫苗规模化生产的需求。

Lin等[10]的研究表明,EV71的Vero细胞适应株YN324a具有弱毒、高产率、强免疫原性和传代稳定等特点,是EV71灭活疫苗的理想候选株。

Liu等[11,12]通过对三株EV71病毒(EV712075、EV712117、EV712 1207)采用无血清微载体细胞培养和有血清的微载体细胞培养。

结果显示,Vero细胞培养、无血清、微载体细胞培养技术可以大幅度提高EV71的滴度且能引发更强的体液免疫反应。

灭活疫苗需要多次接种来维持血清抗体水平,且不能直接刺激产生特异性黏膜免疫。

为获得更好的免疫效果,除了上述生产方式的优化,灭活疫苗的免疫效果更多地取决于流行株和疫苗株的抗原相关性,往往仅对同型病毒感染有效,对异型病毒感染效果较差,虽然不同亚型的EV71间存在交叉抗原表位,可以提供交叉保护,但是不同亚型间也存在差别[13]。

这些差别是很重要的,因此必须随着疫情发展和毒株的变异而更新EV71疫苗株。

但新流行的变异株为Ver o细胞适应株时才能在短时间内大量生产以制备疫苗,所以可用反向遗传学技术,将Vero细胞适应株和流行株进行重组,既可缩短疫苗株的筛选时间,又可以实现交叉保护效果。

2病毒样颗粒疫苗类病毒颗粒(virus2like,particle,V LP)是由病毒衣壳蛋白组成的空壳粒子,结构上非常类似真实的病毒,但由于不具有病毒的遗传物质而没有感染宿主的风险。

此外,它能高密度地展示病毒抗原表位,引发强有力的特异性体液免疫和细胞免疫而备受青睐,因此它对于多种疾病来说都是一种可开发的理想疫苗形式。

在最近的报道中,已有许多临床重要病毒如人类免疫缺陷病毒、流感病毒的VLP被证实能够诱导可观的保护性免疫应答[14,15]。

Chung 等[16]用EV71V LP接种BALB/C小鼠后,能够诱导持续产生高滴度的特异IgG抗体和中和能力,能刺激脾细胞增殖及高水平的IFN2C、IL22和IL24细胞因子表达。

接种VLP的母鼠生产的新生小鼠在1000LD50感染剂量下,可获得8819%的保护率。

与灭活疫苗、变性的VLP相比,EV71VLP具有构象表位,可以引发相当甚至超过的免疫应答,且更具安全性,因此VLP有希望作为疫苗候选。

但是目前仍缺乏一个高效的提纯方法,Chung等获得的VLP 样品纯度仅为40%~50%[16],且由于V LP的稳定性差导致超速离心后回收率太低,因此产量较低。

大量制备时可以考虑添加某种稳定剂以提高回收率,或者发展基于层析法的提纯技术以适应程序化的规模生产。

3合成肽疫苗多肽疫苗作为新兴的候选疫苗,以其明确界定的表位刺激机体产生有效、特异的保护应答,和具有生产方便、安全、稳定等优势赢得人们的青睐。

有关EV71的亚单位疫苗研究已经显示,VP1蛋白是主要的病毒中和决定子,包含了重要的抗原表位,能刺激机体产生高滴度保护性中和抗体[9],VP1多肽疫苗的研究也相继被报道。

Foo等[17]对VP1原始系列进行肽探针扫描,发现位于VP1的C端的SP55 (1632177)、SP70(2082222)两肽在体外微量中和实验中能中和EV71病毒,诱发产生的特异性IgG滴度与灭活病毒相当;其中SP70在25株具有代表性的异源EV71毒株中高度保守,能够对其它亚型的EV71毒株提供交叉保护,可以作为抗EV71合成肽疫苗候选。

随后,进一步通过小鼠保护性实验检测合成肽SP70对新生小鼠的被动保护作用,结果显示,在1000T CID50同源和异源EV71的攻击下,抗SP70血清(抗体滴度为1B32)均提供80%的保护率,而抗EV71血清提供100%的保护率[18]。

与完整的EV71抗原相比,SP70获得免疫效果不够理想,可能的原因是SP70的分子量小,结构简单,仅含有线性表位且数量少。

已有报道显示,连接较大的蛋白载体或使用佐剂能提高合成肽的免疫原性[19,20],EV71的中和构象表位存在于VP1的N 端[21]。

因此可以筛选出V P1的构象表位,并与SP70连接构成包含线性表位、构象表位的嵌合肽,以提高合成肽疫苗的免疫原性。

4DNA疫苗DNA疫苗亦称核酸疫苗,即含有特定目的基因的重组表达质粒。

Wu等[9]在进行的EV71疫苗保护效果对比研究时,通过肌肉注射EV71的DNA疫苗免疫母鼠,对其新生小鼠有一定的免疫保护效果,但比福尔马林灭活疫苗效果差;脾细胞体外刺激实验显示,DNA疫苗能促进Th细胞的增殖,并产生较高水平的INF2C和IL212,说明此DN A疫苗主要934第4期李明等:EV71疫苗的研究进展引发T h1型应答。

T ung等[22]构建了EV71的VP1 DNA疫苗,并在体内和体外测试其诱发免疫应答的能力。

母鼠免疫血清ELISA分析显示,抗VP1抗体IgG显著升高,但从第二次加强免疫后开始下降,转而IFN2C和IL22的浓度增加,说明存在体液免疫到细胞免疫的转换。

体外病毒中和分析证明,母鼠免疫血清能够一定程度中和EV71的感染从而阻止CPE的产生,但差于人的阳性血清的中和效果。

DNA疫苗可激发机体特异性体液免疫和细胞免疫应答,免疫期长,具有生产成本低、易于大规模生产和保存等优点。

但是DNA疫苗所激发的免疫反应强度相对较弱,不足以引起足够的免疫保护效果[22]。

因此设计各种新的DN A疫苗方案已成为研究的热点之一。

研究者正尝试通过多种途径增强免疫效果:¹改善免疫途径。

EV71系肠道病毒,主要通过消化道黏膜入侵,IgA的保护性作用尤为重要,因此可以从鼻黏膜、口腔黏膜接种疫苗并辅以黏膜佐剂来加强黏膜免疫;º优化改造表达载体。