安徽大学本科毕业论文（设计、创作）题目：山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研究学生姓名：孙义学号：D3*******院（系）：生命科学学院专业：生物工程入学时间：2012年9月导师姓名：班谦职称/学位：博士导师所在单位：安徽大学完成时间：2016年5月山羊肺泡巨噬细胞体外分离与原代培养技术研究摘要肺泡巨噬细胞是存在于肺泡中的免疫细胞，它是免疫系统的重要组成部分，肺泡巨噬细胞免疫功能非常活跃。

它是肺脏抵御外来微生物侵害的第一道防线。

本次实验通过研究山羊巨噬细胞的体外分离和体外培养技术，从而建立一套完整可行的巨噬细胞分离培养技术方法。

人体吸入空气中的尘粒、细菌等异物进入肺泡和肺间质，多被巨噬细胞吞噬清除，在今天空气污染日趋严重的情况下，研究肺泡巨噬细胞对于免疫学和人类健康有重要的意义。

而研究巨噬细胞分离培养技术将为肺泡巨噬细胞的免疫学研究奠定坚实的基础。

本实验从健康无病变的羔羊肺脏灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，加入脂多糖进行诱导刺激。

实验表明，通过此次实验的方法，获得了高纯度的山羊肺泡巨噬细胞，在CO2培养箱中连续培养30天左右未发现细胞大规模死亡，LPS刺激下发现其仍具有免疫活性。

为进一步通过山羊肺泡巨噬细胞进行各种致病菌导致的疾病的治疗和肺泡巨噬细胞的免疫学功能研究奠定实验基础。

关键词：肺泡巨噬细胞；分离培养；LPS；山羊。

Isolation and primary culture of goat alveolarmacrophages in vitroAbstractAlveolar macrophages are present in alveolar in immune cells, it is an important part of the immune system, immune function of alveolar macrophages is very active. It is the first line of defense against microbial invasion of the lung. This experiment through study on goat macrophages in vitro isolation and in vitro culture techniques, so as to establish a complete set of feasible macrophage separation cultivation techniques. Inhaled dust particles in the air, bacteria and other foreign matter into the alveolar and interstitial lung, is phagocytosis of macrophages, in today's air pollution increasingly serious situation, study of alveolar macrophages is important for immunology and human health. And the study of macrophage isolation technology will lay a solid foundation for Immunology Study on alveolar macrophages. The separation of alveolar macrophages from healthy lamb lung lavage fluid of lesions in this experiment, With lipopolysaccharide induced stimulation. The experimental results show that through the experimental method, goat alveolar macrophages in high purity and in CO2 culture box in continuous culture about 30 days found no large-scale cell death, under the stimulation of LPS found it still has the immune activity. Study on the immunological function of further by goat alveolar macrophages were all pathogenic bacteria caused the disease treatment and alveolar macrophages lay the experimental foundation.Keywords: alveolar macrophages ; isolatedculture ;lps;goat目录：1引言 (2)2 材料与方法 (4)2.1 材料 (4)2.1.1 仪器设备 (4)2.1.2 实验试剂 (5)2.1.3 实验动物 (5)2.2 试验方法 (5)2.2.1 山羊肺泡巨噬细胞分离. (5)2.2.2 原代细胞培养 (5)2.2.3 LPS刺激山羊肺泡巨噬细胞及其形态学观察 (5)3. 实验结果 (6)3.1 山羊肺泡巨噬细胞培养特性 (6)3.2 使用脂多糖刺激山羊肺泡巨噬细胞观察其形态学变化 (6)4. 实验分析 (7)4.1 肺泡巨噬细胞分离培养 (7)4.2 脂多糖诱导形态学观察 (7)4.3 山羊巨噬细胞体外分离培养的意义 (7)5 参考文献 (8)致谢 (9)1 引言随着中国工业化进程的不断发展，粗放的发展方式给自然环境带来了极大地破坏，煤炭，石油，天然气等能源物质的燃烧释放出大量的有毒有害物质，我国的工发展产导致环境不断恶化，工业生产过程中排放到大气中的污染物种类繁多，其中有烟尘、含硫氧化物、含氮氧化物、有机化合物、一些卤化物等等。

其中有的是烟尘，有的是气体。

除了工业污染，交通运输工具如汽车，火车，飞机，也会排放大量的污染物。

空气质量不断恶化，对人体的健康会造成巨大的伤害。

近年来我国癌症发病率不断上升，且成癌症年轻化趋势，其中肺癌发病率和死亡率最高。

除肺癌外其他呼吸道疾病也明显增多，造成呼吸系统疾病跟大气污染密切相关。

大气污染肺脏首先受到冲击，研究肺部免疫细胞对人类健康有重要意义。

肺泡巨噬细胞为单核-巨噬细胞，一般而言，单核细胞的生存周期仅仅只有2~3天而已。

肺泡巨噬细胞是由血液中的单核细胞转移到肺泡后分化演变而来的。

肺脏里存在不同类型的巨噬细胞亚群。

比如，肺泡巨噬细胞，肺间质巨噬细胞,树突状巨噬细胞和血管内巨噬细胞等。

它是肺部最早接触病原微生物和其他病原体的免疫防御细胞之一，生物学功能多样，其中包括免疫调节作用，物质代谢作用，信息传递作用和吞噬作用。

巨噬细胞参与宿主的特异性免疫和天然免疫。

在特异性免疫中，肺泡巨噬细胞能够吞噬、清除自呼吸道侵入机体的外源微生物，同时还可以介导炎性反应；在特异性免疫方面，主要发挥免疫调节功能和呈递抗原物质。

巨噬细胞是肺脏抵抗致病原感染的第一道道防线，肺泡巨噬细胞是研究宿主获得性免疫以及自然感染的理想模型。

一旦肺泡巨噬细胞与致病菌或其他致病原接触。

肺泡巨噬细胞会发生形态学上的变化，肺泡巨噬细胞会伸出假足，假足不断延伸直至将病原微生物或其他病原物质完全包围住形成了一个闭合小体（胞吞）。

紧接着闭合小体与细胞膜分离，通过细胞质运输到溶酶体并与溶酶体结合，溶酶体之中含有各种消化酶，能将病原微生物和其他病原体消化分解掉。

以此过程消灭杀死病原体。

噬菌体杀死致病菌或清除其他致病原后将残余物通过网状皮质系统运送出胞外。

但是目前发现，一些致病菌发生变异后进化出抵御免疫防御系统的能力。

其中典型的有军团菌，分支杆菌和兼性的的细胞内致病菌。

他们再被巨噬细胞吞噬后可以继续在巨噬细胞中生存。

这些致病菌由于生活在巨噬细胞之中，从而不会与内环境中的抗体物质和治疗药物接触。

这些细菌一直潜伏在人体细胞中并不断增殖，最后导致疾病影响人类健康。

肺泡巨噬细胞是实验室中研究肺部免疫功能的重要细胞。

我们一般对肺泡巨噬细胞了解熟悉的功能包括吞噬作用和抗原呈递作用。

吞噬作用即肺泡巨噬细胞以胞吞的方式将病原微生物，细胞碎片等物质运送到细胞体内进行处理。

而抗原呈递作用则是巨噬细胞吞噬病原微生物后将病微生物消化分解处理，并加工处理得到抗原，并将处理过的抗原呈递给T 淋巴细胞和B淋巴细胞，使免疫防御系统进行更加强力的特异性免疫。

其实巨噬细胞不仅可以吞噬病原微生物呈递抗原还能够分泌上百种分子物质。

其中包括了肿瘤坏死因子，补体，白介素，前列腺素等等。

本实验采用LPS（脂多糖）作为抗原物质刺激山羊肺泡巨噬细胞。

我们都知道脂多糖参与形成了革兰氏阴性菌的细胞壁，是细胞壁的重要组成部分。

当细菌死亡溶解或者采取人工方法破坏细菌细胞后脂多糖才会从细胞壁上脱落，这种脱落的脂多糖是有毒性的，称之为内毒素，内毒素会引起发烧，微循环障碍，白细胞和血小板减少，并会损害肝脏。

内毒素在致病菌细胞壁的最外层。

细菌的内毒素毒性都比较弱，各种病原细菌的毒性大致相同。

这次实验采用脂多糖作为抗原物质是为了最大程度模拟山羊在肺部感染致病菌时山羊肺泡巨噬细胞的免疫学作用。

到现在为止，关于肺泡巨噬细胞分离培养技术和方法的报道很少涉及到大型哺乳动物，报道多为大鼠和小鼠等。

关于羊、猪、牛、水牛也有相关报道。

这次研究是进行山羊肺泡巨噬细胞的体外分离培养，同时用脂多糖诱导巨噬细胞发生免疫学变化，观察山羊巨噬细胞形态学变化以确定其是否在离体培养过程中保留了免疫活性。

山羊巨噬细胞是已分化细胞，不能够再继续自我增殖，细胞会自然地衰老死亡，所以在山羊巨噬细胞的体外分离培养过程中，巨噬细胞不可避免的会随着培养时间的延长死亡的山羊巨噬细胞越来越多。

查阅文献，大多数巨噬细胞在体外分离培养的时间在20天左右。

如果此次实验能够从山羊肺脏中获得纯度较高，数量较多的山羊肺泡巨噬细胞，能在体外分离培养较长时间，并且在脂多糖（LPS）的刺激下出现巨噬细胞免疫反应的典型形态学变化。

则可以说明本次设计的分离培养技术方法是可行的。

山羊巨噬细胞是已分化细胞，不能够再继续自我增殖，细胞会自然地衰老死亡，所以在山羊巨噬细胞的体外分离培养过程中巨噬细胞不可避免的会随着培养时间的延长死亡的巨噬细胞越来越多。

巨噬细胞作为抵御病原微生物的重要一员，建立适应于特定物种的体外培养方案尤为重要，鉴于此，本研究选择山羊肺泡巨噬细胞作为主要实验材料，建立体外细胞培养模型，为进一步开展抗病研究和细胞改造打下基础，最终期待能为经济动物抗病研究提供新的依据。