释放出的光学信号而间接确定的。 除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像 ，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更
增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。 直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常 可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。 在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM, NabSys， Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发
外显子组分析工具
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
3
第一代测序技术 ： Sanger测序法 ——简便、快速
4
逐渐被遗忘的测序 技术： Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法
5
Sanger测序的局限
通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp， 原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的
成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到60万碱基。 但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都 已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖, 使其难以进一 步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化
降低测序成本）。 在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation
sequencing)应运而生。
6
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • Illumina SOLID Polonator Complete Genomics
ChIP-seq
RNA-seq
Experiments
• DNA-seq: de novo, resequencing • RNA-seq:mRNA, ncRNA, smRNA... • ChIP-seq: Chromatin ImmunoPrecipitation • Methyl-seq: methylated DNA (epigenome)
，不同的只是采用的方法或策略。
18
19
20
Second generation sequence
• Roche 454 illumia Solexa
ABI SOLiD
Metagenomics De novo sequencing RNA-seq De novo sequencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP) Meth-seq Re-sequencing
问题出发
• 正常样本与异常样本，如肿瘤等； • 药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后； • 发育不同阶段的样本改变
.............
第二代测序数据分析原理
徐汪节
三代DNA测序技术之比较
第一代测序技术：Sanger测序法 第二代测序技术：454测序……
第三代测序技术：？ 直接测序法：？
using pir-end reads. • N50 size. As applied to contigs or scaffolds, that size above which
50% od the assembled
全基因组de nove分析工具
分析所需工具
• Bowtie software SAM tools TopHat softare Cufflinks software CummeRbund software -
14
第二代测序技术的局限
与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台 速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基
的序列不足为奇。 但是, 除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台 的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成
的。 而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
Sequencing Glossary
• Reads. A collection of clones that over-sample the target genome. • Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a
is taken. • Contig. The result of joining an overlapping collection of sequence
reads. • Scaffold. The result of connectiing non-overlapping contiges by
15
第三代测序技术：单分子测序
Helicos Biosciences VisiGen
Pacific Biosciences Mobious Nexus I
……
16
17
直接测序法
在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助 下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中
……
8
454
9
SOLID
10
Illumina
11
其他
Polonator Complete Genomics
……
12
13
第二代测序技术的共同点
1 将目标DNA剪切为小片段 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面
3 单分子独立扩增 4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号
5 高分辨率的成像系统 。
sequencing-library clone. • Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mat
pair library clone which insert size is usually>1kb. • Insert size. The size of the clone-insert from which a clone-end pa