海洋公益性行业科研专项经费项目子任务实施方案项目名称: 基于海洋微生物发酵的新产品开发技术研究与应用子任务名称:发酵法制备N-乙酰氨基葡萄糖关键技术研究与应用子任务编号: 2-4项目承担单位: 国家海洋局第三海洋研究所项目子任务承担单位: 浙江中医药大学国家海洋局二○一四年八月项目子任务信息表项目名称基于海洋微生物发酵的新产品开发技术研究与应用项目编号2子任务名称发酵法制备N-乙酰氨基葡萄糖关键技术研究与应用子任务编号2-4子任务承担单位信息单位名称浙江中医药大学通讯地址浙江省杭州市滨文路548号浙江中医药大学邮政编码310053 联系人姓名程汝滨处（室）药学院职务副研究员联系电话 5 传真 6 手机电子信箱项目起始时间项目完成时间实施年限4年项目子任务经费预算196万元财政拨款196万元其他财政拨款万元单位自有货币资金万元其他资金万元子任务负责人姓名程汝滨出生日期学位■博士□硕士□学士□其他性别男职称副研究员专业海洋药物所在单位浙江中医药大学身份证号码372328X 手机号码办公电话 5参加人数11人。
其中：高级 3 人，中级 2 人，初级人，其他 6 人；博士6 人，硕士 5 人，学士人，其他人。
累计工作时间242人月研究类型□行业应用基础研究□行业重大公益性技术前期预研■行业实用技术研究开发□国家标准和行业重要技术标准研究□计量、检验检测技术研究创新类型□自主创新■集成创新□引进消化吸收再创新预期成果与应用类型■形成专利□形成国家标准和行业重要技术标准■形成实用技术自主研发能力□局部试点示范□业务化运行□较大范围推广应用□研究报告□形成海洋开发与管理应用理论或公益技术□论文论著研究内容（200字以内）建立稳定的N-乙酰氨基葡萄糖合成相关基因的异源表达和功能评价技术，从海洋生物中挖掘潜在的高效氨基葡萄糖合成酶和氨基葡萄糖乙酰化酶基因；通过微生物遗传育种的方法，获得高产N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产菌株；在此基础上优化培养基组成、发酵温度和时间等条件，建立微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖的新工艺，在100L级的发酵罐中进行中试研究；以多种提取技术相结合，建立高效快速的N-乙酰氨基葡萄糖的提取和纯化技术。
考核指标（200字以内）1.从海洋生物中克隆获得高效N-乙酰氨基葡萄糖合成相关功能基因2-3个；2.通过微生物遗传育种改良技术，获得N-乙酰氨基葡萄糖的高产菌株4株以上；3.获得100L级N-乙酰氨基葡萄糖发酵中试工艺技术，5d培养获得N-乙酰氨基葡萄糖30g/L以上；4.建立稳定高效的N-乙酰氨基葡萄糖的分离提取和纯化技术，提取率达到90％以上；5.获得纯度90%以上的N-乙酰氨基葡萄糖样品2kg；6.申请发明专利2项。
编写说明1．本实施方案由项目子任务承担单位负责编写。
2．编写要求：（1）总体目标、年度目标要完整、集中、明确、可考核，要充分考虑经济、技术等方面的可行性；（2）研究任务和内容重点突出，技术路线清晰，技术关键点与创新点明确；（3）项目子任务的组织实施管理等符合项目的特点，配套条件要保障落实，措施具体；（4）经费预算根据充分，符合规定。
3．报告涉及到外文缩写要注明全称。
4．方案文本采用A4幅面纸，小四号宋体字打印，标题用小四号黑体字打印，表格用五号宋体字打印，行距25磅，页码居中，按项目编号顺序附项目实施方案后合并装订，由项目承担单位和项目子任务承担单位盖章后报国家海洋局海洋科学技术司，同时报送电子版本。
5、其他说明：（1）《海洋公益性行业科研专项经费项目信息表》“子任务承担单位信息－联系人”指项目子任务承担单位科技处相关负责人。
（2）承担单位意见和项目子任务承担单位意见必须加盖法人单位公章，二级学院或重点实验室等盖章无效。
（3）子任务编号格式为“项目编号—1”、“项目编号—2”，依次顺延。
项目子任务实施方案填报内容一、项目及项目子任务概述海洋公益性行业科研专项“基于海洋生物发酵的新产品开发技术研究与应用”面对海洋生物资源可持续利用产业发展需求，依托海洋生物发酵工程技术，围绕海洋生物活性产物规模化制备关键技术，研究开发新技术、新工艺和新制品，提升我国海洋活性产物领域的技术创新能力和研究水平，形成系列海洋活性产物成套技术和产品。
项目选择应用价值高、市场前景好的S-腺苷甲硫氨酸、隐甲藻胞外免疫多糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻黄素、褐藻胶改性专用裂解酶和苹果酸脱氢酶等重要海洋功能产物，利用现有的种质遗传改良技术，对目标菌（藻）株进行诱变育种和活性物质调控，从而有效提升海洋生物（微藻）活性产物的产量；建立活性产物生产菌（藻）株的种质改良、规模化发酵、分离提取和检测、活性控制、应用示范等共性关键技术研发链条；着力突破中试工艺技术瓶颈，实现从实验室研发到生产应用的连接，构建海洋生物（微藻）规模化发酵和分离提取的中试研发平台，实现目标产物高效、经济培养；建立目标产物分离提取和检测等关键技术，实现绿色清洁生产；对开发的新产品进行功能、活性、质量和安全性评价，为其产业化生产奠定基础。
形成市场前景广阔、具有自主知识产权的成果，开发出多项产业化前景显著的高附加值产品。
“发酵法制备N-乙酰氨基葡萄糖关键技术研究与应用”作为海洋公益性行业科研专项“基于海洋生物发酵的新产品开发技术研究与应用”项目的子任务之一，主要针对当前N-乙酰氨基葡萄糖发酵生产过程中的共性问题，通过海洋生物中高效的氨基葡萄糖合成相关功能基因的挖掘技术、微生物遗传育种改良技术、发酵工艺的优化和控制和稳定快速的提取分离和纯化技术等多个环节的开发与应用，建立稳定的N-乙酰氨基葡萄糖合成相关功能基因的异源表达和活性评价体系，从海洋生物中挖掘潜在的高效氨基葡萄糖合成酶和氨基葡萄糖乙酰化酶基因；通过微生物遗传育种的方法，构建获得高产N-乙酰氨基葡萄糖的发酵生产菌株；在此基础上，通过葡萄糖流加和溶氧控制等技术，建立微生物发酵法生产氨基葡萄糖的新工艺，并在100L级的发酵罐中进行中试研究；以分子蒸馏法、离子交换发和膜分离等技术有机结合，建立高效快速的氨基葡萄糖的提取和纯化技术；并最终获得N-乙酰氨基葡萄糖样品2kg。
，并申报发明专利2项。
本子任务由浙江中医药大学牵头，国家海洋局第三海洋研究所参与共同完成。
子任务经费共204万元，投入工作量共236人月。
二、必要性及需求分析1．必要性N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）在体内具有重要的生理作用，如参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；作为抗菌消炎药物，治疗风湿性关节炎和胃溃疡等。
目前主要的生产方法为甲壳素水解法。
水解法消耗大量的酸碱，腐蚀设备，环境污染严重，纯化工艺复杂，产品有鱼腥味，存在过敏效应。
相对于甲壳素水解法，微生物发酵法生产不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应。
氨基葡萄糖作为一种市多年的骨保健产品，无疑会有良好的发展前景。
GlcNAc 广泛存在于真菌细胞壁及虾蟹的外骨骼中，是甲壳素与壳聚糖的组成成分。
在自然界中，细菌、酵母、真菌、植物及动物体内也广泛存在GlcNAc。
GlcNAc 也是糖蛋白和蛋白聚糖的主要成分，在人与动物的关节软骨组织中起着重要作用，并大量存在人类眼睛晶状体中。
早在20 个世纪60年代，GlcNAc 就已被大量用于骨关节炎的治疗。
研究表明，它能够有效作用于软骨组织治疗风湿性关节炎，其次对白血病癌细胞具有抑制作用，并有消炎护肝的功效。
GlcNAc 在食品保健领域也有着广泛的应用，在一些欧美国家GlcNAc 被视为天然无害的食品及保健品配料而得到大量推广，而目前国内相关产品较少。
目前，生产GlcNAc 的方法主要有3 种，即酸水解法、酶解法及微生物发酵法。
前两种方法的生产原料基本上来源于虾蟹的外骨骼，即从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或酶解获得GlcNAc。
高浓度的盐酸在一定的反应条件下能够将虾蟹壳中的甲壳素与壳聚糖降解为GlcNAc，但由于浓盐酸的大量使用会带来严重的环境问题，将逐步受到国家相关政策的限制；酶解法是利用壳聚糖酶对虾蟹壳进行降解，现在面临的最大问题是生产效率低下，表现为壳聚糖酶价格较高、转化时间较长及生产成本较高。
且来源于虾蟹壳的GlcNAc 在临床应用过程中会引起过敏体质患者的过敏反应。
所以微生物发酵法生产GlcNAc 得到了越来越多研究者的关注。
相较于酸水解法与酶解法，微生物发酵法生产GlcNAc 具有以下优点：消除了地域季节对原料来源的限制，产品无鱼腥味；生产周期短，强度高；对环境污染较小；不产生过敏反应。
目前，国内外对微生物发酵法生产GlcNAc 的研究相对较少，相关产业尚未形成工业化生产规模。
本项目将通过海洋高效功能基因的挖掘、微生物遗传育种改良、发酵工艺优化和控制和提取分离和纯化技术的研究，提高乙酰氨基葡萄糖的发酵产量，对乙酰氨基葡萄糖的发酵生产有一定的指导和借鉴意义。
2．需求分析N-乙酰氨基葡萄糖存在于所有生物体中，在人体中是透明质酸、硫酸软骨素及硫酸角质素等葡糖胺多糖的二糖单元前体。
N-乙酰葡萄糖胺特异性地作用于关节软骨，对于维持软骨的健康和正常的关节功能具有重要作用；N-乙酰葡萄糖胺可以增加皮肤中透明质酸的含量；此外N-乙酰葡萄糖胺还是合成N-乙酰神经氨酸的前体物质。
骨关节炎是目前非常普遍的一种疾病，给人们健康生活质量带来了巨大危害。
N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）具有人体关节软骨再生和润滑的作用，NIH 项研究发现，GlcNAc和软骨素复合物对于中度和重度的膝骨关节炎患者来说疗效显著。
在欧洲和美国GlcNAc被广泛用作减轻骨关节炎疼痛和残疾的药物。
在美国，GlcNAc及其复合物作为食品保健品拥有多达数十亿美元的市场；在欧洲，GlcNAc作为处方药也具有同等大的规模。
目前，GlcNAc主要是以酸水解虾蟹类、贝壳类等外骨骼中几丁质的方法获得。
传统方法一方面其严格的酸性环境并可能对葡萄糖环进行化学修饰，更为严重的是贝壳类来源的GlcNAc可能会引起人们的过敏反应，安全性值得考虑。
另外，工业化大量生产还受到原材料等方面的限制。
近几年，国内GlcNAc消费需求量迅速激增，建立一种低成本、安全、高效生产GlcNAc的方法无疑具有广阔的市场前景。
与传统方法相比，微生物发酵生产GlcNAc具有环境污染少、原料供应稳定和无致敏因素等诸多优势。
目前N-乙酰葡萄糖胺的化学法水解环境污染严重，水解几丁质的酶合成量低，不利于工业化生产。
微生物发酵因其发酵周期短、产量高引起了越来越多的关注。
三、国内外技术现状、发展趋势N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）是一类重要的氨基单糖，氨基连接在葡萄糖环的2号位的C 上，是黏多糖和几丁质的主要组成成分，广泛地分布于细菌、酵母菌、丝状真菌、植物和动物体内。
在人体内，氨基葡萄糖是糖胺聚糖的二糖单位前体，而这些糖胺聚糖是组成黏膜分泌物、结蹄组织、皮肤、肌腱、软骨和韧带等必不可少的成分。