②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括 启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、 mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序 列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源 基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。
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第一节外源基因在毕赤酵母中的表达
酵母是目前最常用的表达系统之一。 优点：成长快，易培养，成本低，遗传操作方便，能进
限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外 源蛋白是否能在其中获得高产。
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2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转 化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载 体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细 胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制 整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得 多拷贝。
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4、分泌信号
对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌 方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工 程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌 表达的方式。
有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如 果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对 因子(MFa1)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小 的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号 表达外源基因获得成功的可能性大。
随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各 种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之 有效。
而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核 表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工 业化生产等优点。
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原核表达系统： 大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统
外源基因在真核表达系统中表达的3环节： 载体的构建； 构建的载体DNA在真核细胞中的导入； 表达产物的鉴定
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真核表达载体至少要含两类序列：
①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起 始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等， 以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系 统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够 使用的数量。
1、外源基因特性
外源基因在（巴氏毕赤酵母）Pp中表达时，其自身就 是影响表达水平的重要因素。
不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过 提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的 产量。
Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷 贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高
行翻译后加工和修饰
巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）用于基因工程表达外源 蛋白的优点：发酵密度高；外源基因表达量高；
可以建立有效的分泌型表达；（分泌型表达？）
减轻宿主的代谢压力，减少受蛋白酶降解 的危险，方便产物的纯化，也利于二硫键 的正确折叠。
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影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
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3、基因剂量
许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得 到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加 表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组 CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获 得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因 子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高 拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点 杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对 产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在 过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。
A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录;不合适 的mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会使基因 的表达不尽人意。
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提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象， 譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表 达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组 成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整 人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5’ 非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5’ 非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。
因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。
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高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准
Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将 菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放 在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌 蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检 测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法， 每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大 量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上 清液中获得了255mg的重组cD40L。
外源基因在真核 细胞中的表达
Expression In Eukaryotic Host Cells
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DNA
Gene copy number Promoter activity
RNA protein
mRNA stability Ribosome binding site Codon usage Protein stability
Many host-dependent factors
Biological activity
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人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德 国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。
在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有 生物活性的蛋白质——胰岛素。
优势：高产量，操作简便
缺陷：较多哺乳动物蛋白基因很难在此系统表达 产生有功能的蛋白
原因——蛋白表达后的正确折叠和修饰
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真核表达系统：
酵母表达系统 yeast expression system- Pichia pastoris 昆虫表达系统 Insect expression system-Baculoviruses 哺乳动物细胞表达系统 Mammalian expression system