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4.3.1 几种重要的修饰反应 （1） 酰基化反应
（2）烷基化反应
（3）氧化和还原反应
（4）芳香环取代反应 4.3.2 酶分子侧链基团的化学修饰举例 1、巯基的化学修饰
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2、咪唑基的化学修饰
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3、酚羟基的化学修饰
4、胍基的化学修饰
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5、色氨酸吲哚基的化学修饰 6、甲硫氨酸甲硫基的化学修饰
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聚乙二醇： 聚乙二醇是一个线性分子，有良好的生物相容性，在体内不残留，无 毒，无抗原性，是一种优良修饰剂。 活化方法：三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法 三氯均嗪法是一个常用的方法。 三氯均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代
右旋糖酐： 右旋糖酐是由 α-葡萄糖经 α-1, 6 糖苷键形成的多糖，有较好的水溶性及 生物相容性，可用作代血浆。 右旋糖酐链上的相邻双羟基结构经活化后可与酶上的自由氨基相结合。 溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下 活化，然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反应，共价结合。 技术要点：
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造。
化学修饰过程中需考虑的因素 ¾ 对酶性质的了解：活性部位，稳定条件，侧链基团性质，酶反应最适条 件等； ¾ 对修饰剂的要求：分子量，水溶性，活性基团，活化方式，活化条件， 修饰后酶活性的半衰期； ¾ 对反应条件的选择：分子比例，反应条件（反应温度、pH、时间、溶剂 性质、离子强度等）
4.2.2 化学修饰的方法学 1、 修饰反应专一性的控制 （1）试剂的选择：修饰目的；反应生成物容易定量测定；试剂大小
研究酶分子的解离-缔合现象 推算出酶分子大小、形态及构象变化 测定氨基酸残基在酶分子中存在的状态
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利用双功能试剂交联修饰可以测定酶分子中特定基团的距离 2、确定氨基酸残基的功能 e.g. 在丙酮酸激酶的精氨酸残基的修饰反应过程中，伴随着精氨酸残基的修 饰，酶分子可逆地失活，底物保护作用说明酶分子在底物磷酸烯醇式丙酮酸的 磷酸结合位点具有一个必需的精氨酸残基 3、测定酶分子中某种氨基酸的数量
选择蛋白质修饰剂需考虑的问题 修饰反应要完成到什么程度 对个别氨基酸残基是否专一 在反应条件下，修饰反应有没有限度 修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变 是否需要分离修饰后的衍生物 反应是否可逆 是否适合于建立快速、方便的分析方法
修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备的特征 选择性地与一个氨基酸残基反应 反应在酶蛋白不变性的条件下进行 标记的残基在肽中稳定，很容易通过降解分离出来，进行 鉴定 反应的程度能用简单的技术测定
第四章 酶的化学修饰
4.1 概述 酶分子修饰和改造的原因 稳定性不够，不能适应大量生产的需要 作用的最适条件不符 酶的主要动力学性质的不适应 临床应用的特殊要求 酶修饰的方向 核酸水平 蛋白质水平（化学修饰） 酶分子修饰和改造的概念与目的 概念：采用化学或分子生物学方法，通过主链的切割、剪接和侧 链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活 性。 目的：人工改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些 优良特性甚至创造出新特性，扩大酶的应用领域。 酶分子修饰和改造的方向 对酶分子的侧链基团进行化学修饰 过酶分子与大分子结合的修饰 对酶分子内或分子间进行交联 用化学方法合成具有催化活性的酶，如模拟酶 用分子生物学技术对 DNA 或 RNA 进行分子改造，以获得化学结构 更为合理的酶蛋白。 克隆酶或修饰基因以便产生新的酶 设计新基因合成自然界不存在的新酶 体外分子定向进化：在体外模拟自然进化过程（随机突 变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质 或功能的新酶。
4.7 酶化学修饰的应用 理论研究：
酶中特定基团之间距离、氨基酸残基的存在状态、酶的大小、形状和构象、 确定酶活性部位、测定某种氨基酸数量 生物技术领域：
改变酶的最适 pH、改变酶底物专一性、提高酶耐热、酸、碱和有机溶剂的能 力 医药：
解除或降低医用酶免疫原性和抗原性、提高医用酶稳定性、延长医用酶体内 半衰期 4.7.1 化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 1、研究酶的空间结构
活性酯法- a.白蛋白琥珀酰化
活性酯法- b. 活性酯形成反应
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活性酯法- c. 修饰酶反应
4.5.2 金属离子置换修饰 1、 概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法 称为金属离子置换修饰。 只适用于本来在结构中含有金属离子的酶 e.g. α-淀粉酶中的 Ca2+，谷氨酸脱氢酶中的 Zn2+，过氧化氢酶分子中的
（2）反应条件的选择 要求 不造成蛋白质的不可逆变性 有利于专一性修饰蛋白质 反应条件需考虑的因素 反应温度 pH 反应介质和缓冲液组成
（3）反应的专一性 利用蛋白质分子中某些基团的特殊性 e.g. 二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨
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酸作用，却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合 物作用 选择不同的反应 pH 利用某些产物的不稳定性 亲和标记 e.g. 对甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白的活性丝氨酸上 差别标记 利用蛋白质状态的差异 e.g. 在晶体状态下羧甲基化反应的专一性比溶液状态下提 高3倍 2、 修饰程度和修饰部位的测定 光谱法 间接法：同位素标记量；有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振谱、荧光 标记量、修饰剂的可逆去除 3、 化学修饰结果的解释 蛋白质功能改变的解释 如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋白质活性的丧失与修饰 程度一定呈某种化学计量关系 当采用可逆保护试剂时，修饰失活的蛋白质随保护基的去除可重新恢 复活力，而且活力恢复程度应与保护基去除量呈一定比例关系 残基的不稳定性 原始修饰以后，还可能发生共价改变。 没有被发现的修饰 咪唑基、巯基、羧基甚至苯酚的酰化产物在反应条件下不稳定，或在 以后的纯化中被水解，因而检测不出。 有些修饰反应不能检测出来，只是由于它们在蛋白质化学中不占优势 地位，如：色氨酸 4.2.3 酶化学修饰采用的方法 定点突变:利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基,再 对突变的氨基酸残基进行化学修饰,引入一个小分子化合物。例如：改进的枯草 杆菌蛋白酶。 交联技术：使用双功能试剂如戊二醛、PEG 等将酶蛋白分子之间、亚基之 间或分子内不同肽链部分,进行共价交联。 小分子化合物：利用小分子化合物（邻苯二酸酐、氨基葡萄糖、醋酸酐、 硬脂酸等）对酶活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰。 单功能聚合物：单功能试剂的化学修饰可以使酶结合成具有特异功能的单 位或聚合体。最常用的化学修饰剂：聚乙二醇(PEG)及其衍生物。 4.3 酶分子侧链基团的化学修饰
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原因： ¾ 组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成了共价键，破坏了抗原决定簇的结 构 ¾ 大分子修饰剂遮盖抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应
4.6.3 体内半衰期 体内半衰期延长
4.6.4 最适 pH 有些酶经过化学修饰后，最适 pH 发生变化 例如：猪肝尿激酶的最适 pH 为 10.5，在 pH7.4 生理环境时仅剩余 5%-10%的
对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。 α-葡萄糖苷酶利用白蛋白修饰后，肝溶酶体摄入量达 35%，吞噬 细胞仅为 3% 辣根过氧化物酶用聚赖氨酸修饰后，穿透细胞的能力从 0.2%增强 到 15.9% 天然溶菌酶用唾液酸糖肽修饰后，每分钟肝摄入量从 3.2%增加到 34%。
Fe2+，酰基氨基酸酰胺酶分子中的 Zn2+，超氧化物歧化酶分子中的 Cu2+、Zn2+ 2、常用离子 常用二价金属离子 e.g. 将锌型蛋白酶的 Zn2+除去，用 Ca2+置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提
高 20-30%，其结晶酶的酶活力比锌型的结晶酶可提高 2-3 倍。 3、金属离子置换修饰的过程 a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得
4.7.3 蛋白质化学修饰的局限性 化学修饰专一性是相对的 酶的构象有些变化 只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行 研究酶结构与功能缺乏准确性和系统性
本章小结： 掌握酶化学修饰的原理、方法及对修饰剂的要求 了解酶分子侧链基团的常用化学修饰方法 了解有机大分子及蛋白质类对酶的修饰方法 掌握修饰酶的性质及特点 了解酶化学修饰的应用概况
4.6 修饰酶的性质及特点
4.6.1 热稳定性 热稳定性和耐蛋白水解酶增加
¾ 修饰剂与酶多点交联，增强了酶的结构刚性。 ¾ 减少了酶分子内部基团的热振动，固定了酶分子的构象。 例：每分子核糖核酸酶与 6.5 分子的右旋糖酐结合，可使该酶的活力提高到
原有酶活力的 2.25 倍。 4.6.2 抗原性 部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。
4.5 蛋白质类及其它 4.5.1 蛋白质类修饰
血浆蛋白质：被认为是具有较大优越性和前途的一类修饰剂，其中人血 清白蛋白应用较多。
常用方法： 1、戊二醛法：戊二醛双功能基团 2、碳二亚胺法：碳二亚胺作为交联剂 3、活性酯法： （1）原理：根据多肽合成原理发展起来 （2）特点：反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触可能引起 酶失活，减少了副反应的产生，提高了修饰酶的活性回收率 。 （3）工艺步骤：
酶活 ，但用白蛋白修饰后，可保留 60%的酶活。 吲哚-3-链烷羟化酶修饰后，最适 pH 从 3.5 变到 5.5，在 pH 为 7 时，修饰酶
活性比天然酶增加 3 倍。 4.6.5 酶学性质的改变 绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏
常数会增大。 4.6.6 对组织的分布能力变化
具有一定纯度的酶液。 b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，
如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与 EDTA 等形成螯合 物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将 EDTA-金属螯合物从酶液中除 去。此时，酶往往成为无活性状态。