酶组织细胞化学技术酶组织化学技术的基本原理及方法1、金属沉淀反应，如硫代胆碱铜法，可证明胆碱酯酶和酯酶；2、藕联偶氮色素法3、色素形成与染色法一碱性磷酸酶（AKP）AKP最适宜PH值为9.2-9.4，可被金属阳离子或某些氨基酸激活，多见于活跃的部位，如小动脉、肾小管上皮等。

⏹AKP染色方法:1、Gomri钙钴法：AKP为黑色注意事项：此法对含铁血黄素和钙盐也可形成棕黑色沉淀，必要时应予以鉴别。

并且用于透明的二甲苯为AR级别。

2、Gossrau偶氮吲哚酚法：酶活性部位呈暗褐色（坚牢蓝VB）、浅红色（坚牢蓝BB）、蓝色（坚牢紫B）二酸性磷酸酶（ACP）ACP前列腺活性最强，在肝脏内毛细胆管旁活性最强。

⏹ACP染色方法:1、Berry硝酸铅法：ACP为棕黑色，特异性抑制酶是氟化钠。

2、Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法：ACP为红色。

三三磷酸腺苷酶（ATP）ATP分为三类：膜性ATP、肌球蛋白ATP、线粒体ATP，以上三种酶不可用甲醛固定，用冷冻法。

⏹ATP染色方法：1、Wachstein-Meisel镁激活酶法：ATP为棕黑色。

2、Dubowitz-Brooke钙激活酶法：A TP为棕黑色。

注意事项：镁激活的ATP正常肝定位于毛细胆管；钙激活ATP区分于红肌纤维和白肌纤维有意义，对于区分神经性肌萎缩和肌源性肌萎缩有价值。

四胆碱酯酶（CHE）广义胆碱酯酶分为胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶，胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸，主要分布于血浆、胰腺和唾液腺；乙酰胆碱酯酶主要分布于神经肌肉接头等处。

CHE染色法1、Snell-Garrett胆碱铜法：CHE呈黄色或棕黄色。

2、Karnovsky-Roots铁氰化铜法：CHE呈红棕色或深棕色。

核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。

杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。

核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA 或RNA片段。

根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。

Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、芯片杂交（属于固一液相杂交）。

核酸分子杂交技术基本方法：1、固定：多聚甲醛2、玻片和组织切片处理：增强组织通透性和核酸探针的穿透性有以下方法，如消化酶、去污剂、TritonX-100。

降低背景色，多聚甲醛固定后浸入醋酸酐和三乙醇胺。

240度烘烤片子除去RNA酶3、杂交：4、杂交后处理：处理切片用浓度由高到低，但温度是由低到高的盐溶液。

5、显示：免疫组织化学技术在病理诊断中的应用细胞凋亡检测技术组织取材固定及切片技术组织固定一单纯组织固定液1、甲醛渗透力强，固定均匀，组织收缩小，但经乙醇脱水后收缩较大。

非沉淀性固定剂。

注意事项：甲醛长时间存放容易氧化成蚁酸，蚁酸与组织中的血红蛋白形成甲醛色素。

除去甲醛色素的方法：○1Schridde法：75%的乙醇200ml，加浓氨水1ml。

切片脱蜡后处理30min；○2Verocay法：80%乙醇100ml和1%氢氧化钠1ml配置而成，切片脱蜡后处理。

2、重铬酸钾常用1%-3%作为固定剂。

未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀，但可以使蛋白质变为脂溶剂，用于固定高尔基体和线粒体；醋酸化的重铬酸钾可以使蛋白质沉淀，此时染色体可以保存，但线粒体破坏。

重铬酸钾不能与还原剂混合，其常用于配置混合固定液，如Zenker 液、Helly液、Maximov液、Regaud液。

（hmrz液）3、苦味酸易燃易爆，饱和溶液储藏，常用饱和溶液作为固定剂。

能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，对脂类无固定作用，苦味酸可以软化火棉胶和皮肤，苦味酸固定后放入70%的乙醇或者碳酸锂除去苦味酸固定时产生的黄色。

4、升汞单纯应用组织收缩明显，常与醋酸和铬盐配置成混合液。

可以沉淀蛋白质（白、球蛋白），固定后用5%的碘酒脱汞，再用0.5%的硫代硫酸钠脱碘。

5、醋酸低于15度为冰醋酸。

穿透力强，不能保存糖和脂，固定染色体的混合固定液常含有醋酸。

缺点是组织膨胀明显。

6、锇酸强氧化剂不能与还原剂混合（乙醇和甲醛），常用1%-2%作为固定剂。

为脂类固定剂，不使蛋白质产生沉淀。

7、丙酮沉淀蛋白质，各种酶的固定。

8、三氯醋酸沉淀蛋白质，是Susa主要成分，也是良好的脱钙剂。

不能使组织蛋白沉淀的单一固定液包括：甲醛、重铬酸钾（非酸化）、醋酸、锇酸（醋甲重锇）；对脂类固定无效包括：苦味酸、铬酸、升汞、醋酸。

（苦铬升醋）二混合组织固定液1、B-5固定液醋酸钠-升汞-甲醛固定液，用于固定淋巴组织，若不用甲醛则为B-4固定液。

2、Bouin固定液外科活检固定液，适用于结缔组织。

3、Carony固定液DNA、RNA、糖原及尼氏体的固定，不能固定脂肪。

固定速度为1h厚度为3mm。

4、Muller固定液用于媒染和神经硬化组织。

5、Orth固定液用于固定胚胎组织、神经组织、脂肪组织。

黑暗配置、现配现用。

6、PFG固定液多肽抗原固定，用于免疫电镜。

7、PLP和PLPD固定液富含糖类组织固定。

8、Zenker固定液固定肿瘤标本、病毒（Negril包涵体）。

不能固定含血量较多的组织，不能接触金属器械。

9、中性甲醛PH为7，含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。

注意事项：Masson染色选择甲醛升汞、Zenker液、Bouin液；嗜铬细胞固定选择Zenker液；保存糖原选择Carnoy液。

组织脱水1、 乙醇 70-80-90-952、 丙酮 收缩作用比乙醇更严重。

可作为染色后脱水剂，用于DNA 和RNA 染色。

3、 异丙醇 乙醇的良好代替品，不溶于火棉胶和染料。

小结：含汞的固定液有B-5orB-4、Zenker 固定液；含有醋酸的固定液是Bouin 固定液、Carony 固定液。

常用特殊染色技术一 结缔组织三联法显示胶原、网状、弹性纤维结果为：胶原纤维为红色、网状纤维为黑色、弹性纤维绿色、肌肉和红丝宝为淡黄色。

二 胶原纤维染色 注意事项： Ⅰ型胶原纤维：紧密排列、很强的双折光性。

Ⅱ型胶原纤维：弱双折光性、多彩疏松分布。

Ⅲ型胶原纤维：弱双折光性、绿色细纤维。

Ⅳ型胶原纤维：弱双折光的基膜、呈淡黄色。

三 网状纤维1、Gordon-Sweets 银氨染色法：网状纤维为黑色。

网状纤维染色的作用：区别恶性肿瘤来源。

四 弹性纤维1、Gomori 醛复红染色法同时对肥大细胞、脂褐素、乙肝表面抗原、胃主细胞也可以很好地着色。

注意事项：Gomori 醛复红染，已甲醛生理盐水固定最好。

五 弹性纤维和胶原纤维的双重组合染色法维多利亚-丽春红染色：胶原纤维为红色、弹性纤维为绿色。

六 糖类染色 PAS ：糖原及其他PAS 阳性物质为红色，细胞核为蓝色。

用Carnoy 固定液或无水乙醇固定。

七 肌肉组织染色1、横纹肌组织染色Mallory 磷钨酸苏木精（PTAH ）：横纹肌为蓝色、缺血、缺氧心肌为紫蓝色或棕黄色。

用zenker液或中性甲醛固定。

2、早期心衰病变组织染色八粘多糖九含铁血黄素普鲁士蓝：含铁血黄素为蓝色，长久存放的标本应用高锰酸钾漂洗。

十淀粉样物质十一真菌染色十二病毒包涵体染色RNA病毒包涵体在胞质中形成；DNA包涵体在核内形成。

包涵体染色用Macchiavello染色十三乙肝表面抗原染色十四神经组织染色1、神经细胞尼氏小体染色方法2、神经纤维染色方法十五DNA染色显示DNA常用Feulgen染色法，此过程通过酸水解，打开DNA的嘌呤碱基-糖苷键，释放出反应型醛基，有力的醛基与Sciff试剂，形成紫红色复合物，从而显示DNA，需做DNA酶消化对照。

注意事项：酸水解-无色品红法应用：肿瘤诊断，测定DNA含量有助于判断肿瘤的良恶性及分化程度，免疫性疾如免疫缺陷、自身免疫病及过敏反应。

在60度1mol/L盐酸水解后，此实验关键是酸水解。

十六脂肪染色苏丹Ⅲ染色：中性脂肪为橘红色，细胞核成蓝色。

注意事项：1、苏丹Ⅲ是一种偶氮染料，不溶于水，稍溶于脂肪。

2、脂质不能用乙醇、三氯甲烷等固定液，用甲醛固定。

不用于石蜡，用于冷冻切片。

免疫细胞组织化学技术一抗体标记物一）荧光标记物二）酶标记和酶标记法1、辣根过氧化物酶（HRP）：正常组织，如粒细胞、骨髓造血及成熟的红细胞均含有过氧化物酶，易引起DAB的假阳性。

抑制剂为叠氮钠、重铬酸钾、氰化物及氟化物。

2、碱性磷酸酶（AP）：肝、胎盘、小肠绒毛、肾小管局含有内源性过氧化物酶，除去内源性AP用左旋咪唑。

石蜡包埋时小肠上皮内源性AP基本灭活。

三）亲和组织化学标记物1、生物素亲和素系统；2、葡萄球菌A蛋白（SPA）与IgG；二免疫组织化学方法原理一）直接法二）间接法三）未标记抗体法1、酶桥法：使用三种抗体进行染色，其中第一、三抗体为同种动物产生。

2、PAP法：细胞抗原（人）+特异性抗体（兔抗人IgG，一抗）+桥抗体（羊抗兔IgG，二抗）+PAP复合物（兔抗IgG+过氧化物酶复合物）形成总复合物+过氧化物酶的底物—显色3、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法（APAAP）：在PAP的基础上，AKP代替HRP。

在血、骨髓、脱落细胞最常用。

注意：桥抗体必须过量四）亲和素-生物素方法1、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（ABC）：通过ABC复合物中亲和素中的桥梁作用，将ABC复合物与生物素化的抗体，结合在一起。

ABC的配制是将亲和素与酶标生物素按一定比例结合而成。

2、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶（SABC）：是ABC的改良法，链霉素代替ABC中的亲和素。

3、链霉亲和素-过氧化物酶复合物法（SP）：SP法用链霉亲和素直接与过氧化物酶结合，形成链霉亲和素-过氧化物酶复合物（SP）。

五）Envison和催化放大系统（CSA）Envison法的基本原理是利用线状的葡聚糖分子与大量的酶（AP或HPR），再将葡聚糖-酶复合物接到第二抗体上，形成酶-葡聚糖-第二抗体复合物。

催化放大系统在链霉素-生物素法可以使原始信号几何数放大。

注意事项：1、免疫组化染色选择原则有特异性、敏感性、简便性、安全性、省时省钱。

2、增强特异性染色方法：蛋白酶消化法、合适的抗体稀释度、孵育时间、多层染色法、加热法。

3、消除非特异性染色：第一抗滴加前与制备第一抗体相同的非免疫性血清。

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