10-11g ／mL 。
HPLC应用广泛
➢ 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量 的准确性，特适于非挥发性和热不稳 定组分的分析，因此，在医药、食品、 农业、生命科学、化工、环保等领域 都有着广泛的应用。
➢ 如氨基酸、蛋白质、核酸、碳水化合 物、药品、多糖、高聚物、农药、抗 生素、胆固醇、金属有机物等分析， 大多是通过HPLC来完成的。
chromatography, CBPC） 反相离子对色谱
➢ 液-固吸附色谱 （Liquid-solid adsorption chromatography, LSAC）
➢ 离子交换色谱（Ion-exchange chromatography） ➢ 空间排阻色谱（Size-exclusion chromatography） ➢ 亲和色谱法（Affinity chromatography）
脱气装置： 将气体从溶剂中除去，离线脱气和在线真空脱气。
高压输液泵： 恒压泵、恒流泵 恒流泵使用最广泛，有单活塞和双活塞往复泵。 流量准确、可调，流速为0.5～2 mL/min，泵最大流
量范围为5～10mL/min（排气泡）。
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流动相
HPLC 级溶剂 水为超纯水 过滤 (最大0.45 μm, 0.2 μm最好) 脱气，尤其在低流速时 相溶
各种HPLC方法的应用范围及对象 3
HPLC与GC的比较
液相色谱（HPLC）
气相色谱（GC）
相同点
色谱柱可反复使用，分离效能高，高灵敏度，进样量小，分 析速度快，使用范围广
分析对象 高沸点、不稳定的天然产
物、生物大分子、高分子
化合物、离子型样品
流动相
不同极性的液体（有一定 亲和作用）
气体、沸点较低、热稳定性好的 化合物
四、基本分离原理
色谱过程：在有互不相溶的两相——流动相和
固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组 分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进 行分配的过程。 由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同， 在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同 的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离。
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基本分离原理
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三、Agilent-1100 液相色谱仪
Agilent 1100仪器结构图
✓高压输液系统：单元、双元、 溶剂柜
四元泵
脱气机
✓进样系统：手动、自动
泵
✓分离系统：C18、C8色谱柱 ✓检测系统：检测器
手执控制 器
柱温箱
自动进样器
检测器
1、高压输液系统
储液器： 0.5L～2L的玻璃瓶（白色、棕色）。
2、进样系统
液相色谱手动进样器
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准备时，流动相直接进柱，进样口1与定量管 连接，样品充满定量管后，多余样品从2流出。
进样时，泵将流动相压入定量管，将样品全部 携带进入色谱柱分析。
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注射器
气相色谱注射器的针头为尖， 液相色谱的注射器针头为平， 两者不能混用。
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3、色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长１0 ～30 cm， 固定相粒径 5 ～10μm 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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• 手性色谱柱-------是由具有光学活性的单体， 固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相， 来实现外消旋物的广泛分离。
特点：具有专一性、通用性不广。 价格较贵。
4、液相色谱检测器
• 紫外吸收检测器（Ultraviolet Visible Detector，UVD） 目前在HPLC中应用最广泛的检测器。包括： 可变波长紫外检测器（VWD） 二极管阵列检测器（DAD）
• 荧光检测器（折光检测器（Refractive Index Detector，RID）
The Good User
下列优良/常规实验操作能够延长仪器寿命：
流动相和样品进行过滤。 保证溶剂的相溶性。 仪器使用完毕，冲洗整个系统，去掉盐份，防止污染。 对仪器进行定期维护和保养。 定期使用甲醇或异丙醇冲洗系统。
对羟基苯甲酸酯的HPLC分析
二、HPLC 简介
1967年，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)正式问世。
✓高压：流动相为液体，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液 加高压，300～600×105 Pa。 ✓高速：分析速度快、通常分析一个样品在15～30分钟，有些 样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 ✓高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 ✓高灵敏度：紫外检测器可达10-9g／mL，荧光检测器可达
色谱分析法的实质：不同溶质分子因结构不 同而与流动相及固定相的相互作用力不同， 从而引起在色谱柱内运行过程中作用机理 的差异。经过柱内多次作用的叠加后在宏 观上引起其在柱内停留时间（保留时间） 的差异，形成事实上的分离。
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主要色谱类型
➢ 分配色谱： 液液分配色谱（Liquid-liquid partition chromatography） 化学键合相色谱（Chemically bounded phase
惰性气体（无亲和性，只起运载 作用）
温度 检测器
一般室温
较高
紫外吸收检测器（光电二 极管阵列检测器），荧光 检测器，电化学检测器， 蒸发光散射检测器，质谱 检测器，示差折光检测器
氢火焰离子化检测器（FID），热 导检测器（TCD)，氮磷检测器 （NPD），火焰光度检测器 （FPD），电子捕获检测器 （ECD)等类
色谱柱
• 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质， 表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。 样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最 先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上 有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8 （MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl） 等。
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具 有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基 团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他 极性基团极性较强，因此，分离的次序是 依据样品中各组分的极性大小，即极性较 弱的组份最先被冲洗出色谱柱。