大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化
●实验目的：
1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法
2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋白质诱导表达的方法
3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC试剂盒测定PEPC的活力。

●实验原理：
1. 钙转法：Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。

当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，lacI编码的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。

IPTG为乳糖类似物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。

3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作用来分离物质的层析方法。

组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。

组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化.
4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC.
酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。

该反应消耗一分子的三磷酸鸟苷以提供磷酰基。

在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。

5. 表达载体：pET28a，表达常用载体，图谱如
下
实验步骤：
1．感受态细胞的制备并利用试剂盒提取大肠杆菌质
粒
挑取单克隆过夜培养，转接，摇至OD600等于
0.4，离心收集菌体，以0.4倍体积ccc1洗三次，至菌液呈乳白色，离心收集菌体，加入1/25的ccc2混匀，置于冰上（15 ~60 min），分装，100 μL每份，-80 ℃保存。

同时用kit试剂盒提取大肠杆菌BL21(DE3)质粒。

2．转化
100 µL的感受态细胞分成2管，实验组将2 µL重组质粒DNA加入到50 µL感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P+）阴性对照组将2 µL无菌水加入到50 µL
感受态细胞EP管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打)（标记P-）；冰浴10 min；热击42 ℃，90 sec，静置，勿摇动；迅速放到冰上，冰浴2 min。

复苏：加入800 µL LB液体培养基（无抗性），标明组号（10组），37 ℃，150 rpm摇床，15 min，复苏时，倒三块LB平板（两块有抗性，一块无抗性），涂布培养第二天中午观察结果。

从平板上挑取单克隆划线扩大培养低温保存(助教做)
3. 诱导
原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，挑取单克隆，过夜培养（小摇）。

取2mL菌液转接于50mL kana LB培养基，摇床培养约1小时至OD600=0.5左右，开始诱导。

取1.5mL EP管2支，收集约3mL未诱导菌液，备用。

三角瓶中加入IPTG 100uL(0.5M)至终浓度为1~2 mM，继续培养。

37摄氏度诱导3h即可破碎细胞收集蛋白。

取1.5mL EP管2支，收集约3mL诱导后菌液，备用。

4. 破碎菌体
每组取2支预冷的50ml离心管，每支离心管取约20ml菌液，冷冻离心机4℃，3000rpm 离心10min。

取10ml bufferA ，用枪吹打将沉淀的菌体打散，将两支离心管的菌液混合。

冰上破碎：将离心管插在冰上，超声45分钟（3s，5s）。

4℃离心，12000rpm，1h（注意严格配平），同时制SDS-PAGE胶。

离心结束后，跑胶验证（诱导前的上清、沉淀，诱导后的上清、沉淀）目标蛋白是否可溶。

5. 目标蛋白的分离与纯化
取已填充好的镍柱，用10ml ddH2O 冲洗柱子，用10ml bufferA平衡柱子，配置梯度浓度咪唑（与3、4同步进行），上样（重复上样三次以上），收集流川液作为①号样，用梯度浓度咪唑洗脱，收集2-8号样，用完树脂，用5ml bufferA 冲洗，再分别用10ml ddH2O和20%乙醇冲洗后回收。

（20%乙醇浸润树脂保存）。

制SDS-PAGE胶，跑胶观察目标蛋白被多大浓度咪唑洗脱。

6. PEPC试剂盒测定酶活，参见试剂盒说明书。

实验结果：
1. 1,2两平板有菌落生长，3平板菌落极少。

可能原因：BL21菌株本身生长力旺盛，可能由于倒平板时温度过高，抗生素部分失效，以至于不含质粒的菌也能在平板上生长。

或者菌液浓度太大，以至于抗生素不足以完全抑制菌的生长。

第一次提质粒电泳图如下：
2. 诱导后SDS-PAGE电泳，诱导后目标蛋白有增加，但不明显。

3. 分离纯化蛋白后，SDS-PAGE电泳，图如下：
目标蛋白条带
4. 计算酶活
10U/mL:△A标/t=0.213 ，5U/mL :△A标/t=0.113 ，1U/mL :△A标/t=0.020
阴性对照：△A对/t=0.002 根据标准酶活力，绘制标准曲线
样品：△A样/t=0.015 计算样品酶活力为0.75U
思考与讨论
1.涂三个平板的目的是什么？两两对照分别能够证明什么问题？
图三个平板目的是构成对照，转入质粒，且在抗性板上的菌能够长出来，说明得到了正确的转化子，即菌有抗性，含有重组质粒。

如果无抗板也能长出菌落，则说明感受态细胞没有问题，正常情况下，没有质粒的感受态细胞不能在抗性板上生长，如果有菌落则说明抗生素有问题，或菌自身带有抗性。

2. 制备感受态细胞为什么要取OD600约为0.4的菌？
OD600约为0.4时，菌处于对数期，生长快，代谢旺盛，感受态细胞需要能够快速复苏，且要具有一定的活力，因此选择对数期的菌最为合适。

3. 为何诱导蛋白使用BL21(DE3)菌株，而不是直接诱导DH10B？
DH10B不含有能够识别T7启动子的RNA聚合酶，而BL21(DE3)中DE3基因能够表达这一酶，因此必须选择BL21(DE3)才能表达出蛋白。

4. 为什么不直接用乳糖诱导，而是用乳糖类似物IPTG诱导？
乳糖既是诱导物，又是微生物可以利用的碳源，因此其诱导稳定性较差；IPTG是乳糖类似物，但是它不能被微生物利用，可以一直存在，其诱导稳定性好，不用连续投料。

工业生产中往往使用乳糖诱导表达蛋白质，其价格低廉，也一举两得。

5. 为什么使用镍离子纯化蛋白？
镍属于过渡金属元素，镍离子核外有较多空轨道，易于和一些有孤对电子的原子形成配位键，镍附近的钴、铜等元素的离子也可与组氨酸配位，但是钴离子和铜离子氧化性较强，对蛋白伤害较大易造成变性，因此不适合用于纯化蛋白。