微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的Vc含量
摘要：维生素C是一种水溶性维生素。
在人体中为维持人体健康发挥着重要的作用。
在本实验中，将市场上新鲜猕猴桃榨汁后，用微波辅助提取维生素C。
配制出一系列标准浓度的维生素溶液，在265nm波长的光下用高效气相色谱测量其峰面积，并作出其峰面积-浓度曲线，得到其关系式。
通过测出三组样品的峰面积，代入公式中计算维生素C的含量。
实验测出猕猴桃中维生素C含量为56.95 mg·L-1，RSD为5.3%。
关键词：微波辅助提取液相色谱法维生素C 标准曲线
1 引言
维生素C是一种水溶性维生素，在所有维生素中，维生素C是最不稳定的，在贮藏、加工和烹调时，极易被氧化和分解。
而维生素C是维持人体健康的最重要的维生素之一，人体不能自身合成，必须以食物形式获取。
研究发现维生素C 的缺乏可导致坏血病和免疫力底下等多种疾病，其在人体中的含量高低常作为某些疾病诊断及营养分析的重要指标。
因此抗坏血酸的定量分析在食品、医药领域相当重要[1]。
目前测定抗坏血酸含量的方法有很多，其中包括碘量法[2]、紫外分光光度法[3]、伏安法[4]、红外光谱法[5]、库伦滴定法[6]和液相色谱法等等。
本实验采取微波辅助提取，快速、简便地萃取中蔬果中的维生素C，并采用高效液相色谱法进行分析，以维生素C标准系列溶液色谱峰面积相对其浓度做校准曲线，根据样品中维生素C的峰面积，由校准曲线计算其浓度。
2 实验部分
2.1 试剂
乙腈：色谱纯；
冰乙酸，维生素C，磷酸二氢钾：分析纯；
Vc标准溶液：快速准确称取0.025 g Vc，用1 mol/L乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL容量瓶中，用1 mol/L乙酸溶液定容，得到100 mg/L标准溶液备用，现用现配；
猕猴桃一个。
2.2 仪器
平头进样器；
高效液相色谱仪：LC-2010C（岛津香港有限公司）；
微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；
色谱柱：依利特或Phenomenex C
18
柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)。
2.3 色谱条件
流动相：3%的乙腈-0.05 mol/L KH
2PO
4
水溶液（v/v）；流速1 mL/min；柱
温30℃，紫外检测波长265 nm；进样量10 μL。
2.4 实验步骤
2.4.1 仪器与样品准备
按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。
准确称取切碎的猕猴桃样品5.0 g，以1 mol/L乙酸50 mL为萃取溶剂，微波功率设为600 W，萃取时间为10 min，萃
取温度设定为50℃，平行萃取两次。
萃取液过滤后用1 mol/L乙酸溶液定容至100 mL，制成供试品溶液。
2.4.2定性分析
分别取10 μL 50 mg/L的Vc标准溶液和供试品溶液，进HPLC分析。
根据保留时间定性分析蔬果中的Vc。
2.4.3校准曲线绘制
分别配制5，20，50，80，100 mg/L的Vc样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定3次。
以Vc色谱峰面积对浓度作图，绘制校准曲线。
2.4.4定量分析
供试品溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。
平行测定2次，记录
其Vc的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中Vc的含量，结果以mg/100 g
表示。
3 实验结果与讨论
3.1实验结果
测量5个梯度浓度的标准Vc样品溶液的色谱图，其中保留时间相同的即为Vc，峰面积和保留时间如下表所示：
表1 Vc标准溶液的保留时间和峰面积
样品浓度/mg·L-1 保留时间/s 峰面积
5.00 2.558 161973
20.00 2.578 697112
50.00 2.587 1777821
80.00 2.598 2807447
100.00 2.597 3425944 根据上表作出样品浓度对峰面积的关系图：
图1 Vc标准溶液的浓度和峰面积关系图
根据表格中的数据可以计算出，Vc溶液浓度c和峰面积A之间的线性关系为：A=34564.58c-11265.64，两者的相关度系数R2为0.9992。
将三份待测样品放入色谱仪中测量，读出在265nm处峰随时间变化的曲线，三幅图叠加如下图：
t/s
图2 样品色谱图
得到的实验数据如下表所示：
表2 Vc标准溶液保留时间与峰面积
样品编号样品质量/g 保留时间/s 峰面积
1 5.0828 2.644 1050168
2 5.0461 2.631 955097
3 4.9969 2.620 939317
将上表中的峰面积数据代入标准曲线方程计算出溶液中Vc浓度，折算成水果中的Vc含量，结果如下表所示：
表3 Vc含量测量结果
样品编号溶液Vc浓度/mg·L-1 猕猴桃中Vc含量/mg·100g-1 R.S.D
1 30.71 60.42
2 27.96 55.41
5.3%
3 27.50 55.03
3.2思考题
3.2.1校准曲线法有何优缺点？液相色谱法中常用的定性定量方法有哪些？
运用校准曲线法时，绘出校准曲线之后，在相同实验条件下测定不同样品中的含量只需与标准曲线对照定量就好，适用于简单体系和大量样品的分析；但另一方面，标准曲线法受分析色谱条件的影响很大，当待测样品成分比较复杂，基体干扰比较大的时候，很难找到合适的基体来配置标准系列，会有较大的误差。
液相色谱法中常用的定量方法有归一法、校准曲线法、内标法和标准加入法
参考文献：定性方法有利用保留时间定性分析或者与结构表征的检测器联用进行定性分析。
3.2.2如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？
建立未知物的液相色谱方法应该考虑两个方面的因素，一方面是选择合适的色谱柱，色谱柱是液相色谱分析的核心组件，应根据分析对象的性质选取合适的色谱柱，如正向色谱、反向色谱和离子交换色谱等等；另一方面是流动相的选择，溶剂的极性是选择的重要依据，应该使用高纯度试剂做流动相，防止微量杂质长期积累和损坏色谱柱和使检测器噪声增加，同时应避免流动相与固定相发生作用使柱效下降或者损坏柱子，试样在流动相中应有适宜的溶解度防止沉淀在柱中积累还有流动相要满足检测器需求。
3.2.3微波辅助萃取法为何能达到快速高效的萃取效果？
微波具有穿透到物质内部的本质，穿透的深度一般是从几毫米到几十厘米的范围，随频率不同而异。
所以除了极大的物体外，微波能做到被加热的物体里外同时加热，这就大大缩短了加热时间，微波的这种加热速度快、均匀特点使得在用微波辅助提取技术时，消耗的时间和原料、试剂量都有显著的减少。
3.2.4试比较液相色谱法和气相色谱法的优缺点。
液相色谱法分离效率较气相色谱法低，需使用有机溶剂呃价格昂贵的高压泵，价格和运行费用较高，优点是能分离和分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，其流动相可选用不同极性的液体，对组分可产生一定的亲和力，对分离起很大的作用，并且在室温下工作；气相色谱分离效率高，费用低，故障率低，但只限于分析气体和沸点较低的化合物，适用面较窄，而且一般都要在较高温度下进行。
参考文献：
[1]俞洁敏,傅晓航,李成平:库伦滴定法测定VitaminC片及黄瓜、青椒中抗坏血酸的含量.广东微量元素科学,2008,15(4):44-46
[2]库尔班江,塞丽曼:碘量法测定水果蔬菜中VC的含量.伊犁师范学院学报,2007(3):28-32
[3]连轻工业学院．食品分析．北京：中国轻工业出版社，1999．
[4]邓培红，张军，匡云飞等:普鲁士蓝修饰炭黑微电极同时微分伏安法测定多巴胺和抗坏血酸．理化检验：化学分册，2006，42(11)：933—935．
[5]程存归,缪吉根,徐宇峰: 漫反射傅里叶变换红外光谱法测定维生素C片剂中抗坏血酸的含量.分析化学,2001,29(10)
[6]贾侯旭,王建平,赵晓莲,周俊彦:库伦滴定法测定维生素C含量.吕梁高等专科学校学
报,2001,3(17)。