DNA电化学生物传感器的研究进展摘要：随着疾病诊断、基因测试、法医鉴证、生化战争预防、环境监测等领域的发展,对特定DNA序列进行准确、简单、快速的检测越显重要。

DNA生物传感器主要是利用碱基互补原理对目标DNA进行检测,当已知序列DNA探针与被检的DNA序列发生杂交反应,来辨明DNA的存在与否。

其中,电化学DNA生物传感器利用杂交原理及电化学标记物为杂交检测信号,具有操作简便快速、信号灵敏,能与DNA生物芯片兼容等优点,具有非常重要的研究价值。

目前电化学DNA检测方法以其轻巧便宜、高灵敏度、方便携带、能耗少、易于实现微型化等优点,受到了广泛的关注,成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。

关键词：DNA生物传感器；电化学检测；电化学信号传感器是一种获取外界信息的装置和系统,是人类感官功能的弥补和延伸。

作为一类特殊的传感器,生物传感器以生物活性物质作为敏感元件,在实现机理上更接近于生物体本身的感官系统。

生物传感器是指传感器的分子识别元件即敏感元件为具有生物活性的材料,该部分与相应的换能器的结合,能实现对某些特定化学物质作用变化检测并产生相应的可检测信息，比如光电效应、热效应、场效应、声效应和质量变化等[1]。

生物传感器具有选择性强、分析速度快、操作简便，能够在线监测分析甚至活体分析、能检测极微量污染物的优点、电化学生物传感器将电化学强大的分析功能与生物识别过程的特异性相结合，通过生物反应产生一个与被分析物质浓度相关的电信号。

脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)又称去氧核糖核酸,是染色体的主耍化学成分,可组成遗传指令,以引导生物发育4生命机能运作。

在低浓度下对特定序列的DNA进行灵敏、快速、简单的检测在基因分析、疾病诊断、食品污染、法医鉴定等领域越来越受到重视。

作为一种利用碱基配对原则进行识别的技术,DNA生物传感器利用DNA分子作为分子识别元件即敏感元件,通过转换器将杂交过程所产生的生物学变化信号转换为可检测的光、电、声等物理信号从而实现对特定序列的DNA片段快速、灵敏和选择性的检测。

近年来基于电化学检测方法的DNA电化学生物传感器以其轻巧便宜、高灵敏度、方便携带、能耗少、易于实现微型化等优点,受到了广泛的关注,成为当今生物学、医学领域的前沿性研究课题。

核酸分子杂交技术(ucleioacidmoleeularhybridization)是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。

不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补序列,即可按碱基配对规则以氢键相结合。

通常是先对一种核酸进行标记(如放射性同位素355,32P或生物素等)作为探针,去探测另一种核酸序列。

核酸分子杂交可以在DNA与DNA,RNA与RNA,或DNA与RNA之间进行。

由于这种技术具有高度的特异性和灵敏性,已广泛应用于生物学、医学科学研究，临床传染病和遗传病的诊断。

目前大多数DNA生物传感器都是建立在DNA分子杂交基础上的。

一些非放射性的新的标记方法如荧光法、化学发光法电化学法等取代了传统的放射性同位素标记法,这些检测方法与DNA分子杂交技术相结合,组成各种类型的DNA生物传感器。

DNA生物传感器既免去了放射性标记的辐射危险性,又节省了电泳操作耗时长的缺点,具有操作简便、快速灵敏、高选择性、无污染等优点,同时具有分子识别、分离纯化基因等功能[2]-[3]。

1.DNA电化学传感器原理及结构DNA生物传感器基本的原理是DNA碱基的互补配对，通过电极表面固定的已知捕获DNA序列与检测样本中DNA的互补配对作用形成可传递电子的双链DNA。

从电极上电信号的变化来对样本中的DNA进行定性检测"当加入样本中的DNA序列与捕获探针上的序列存在非配对现象，则电子传递链断开，产生的电信号就很微弱，因此通过电信号变化就可以检测出样本中是否存在突变。

DNA 电化学传感器一般是由敏感元件即生物敏感膜、转换元件即转换器、信号输出三个部分组成，其中敏感元件和转换元件是生物传感器最主要的两个部分。

电化学DNA 传感器的工作过程大致如下:一是DNA 探针的固定。

即采用有效的方法将探针DNA 固定在电极表面,形成DNA 探针电极；二是杂交过程。

将DNA 探针电极浸泡在待测溶液中，在合适的条件下进行杂交反应;三是杂交信号的指示。

通过引入杂交指示剂将杂交信号转化为可测定的电化学信号；四是电化学信号的检测。

可被检测的电化学物理量有电流、电压和电导[3]-[4]。

2.DNA电化学生物传感器的制备探针DNA 在电极表面的固定及杂交指示剂的选择和运用是电化学DNA 生传感器制备过程中的关键步骤,也决定了传感器的最终性能。

将单链探针DNA 固定到电极表面称为DNA 的固定化,是DNA 电化学生物传感器制备中的关键技术。

目前DNA 固定方法常用的有化学吸附法、亲和素-生物素亲和力结合法、共价键固定法。

化学吸附法:化学吸附法是一种简单的将DNA 固定到电极表面的方法,该法不需要试剂也无需对核酸进行专业修饰。

最常见的是电化学吸附法,被广泛用于碳电极。

化学吸附法是一种最简单的DNA 固定方法,固定速度快,不需要特殊的试剂，也无须对DNA 片段进行修饰。

但是通过吸附固定的DNA 在高盐浓度的环境中易从电极表面解脱,所以不宜在高盐浓度条件下使用。

而且它是多位点的吸附,甚至DNA 可能平躺在支持物表面,因而DNA 固定密度较小,多位点固定使DNA 自由度减小,在杂交反应中影响其与互补DNA 的杂交效率。

亲和素-生物素亲和力结合法:亲和素(avidin)是四聚物大蛋白分子(70 kDa),具有四个一样的结合位点,生物素(biotin)是小分子,与亲和素具有很高的亲和力(Ka=1015 M-1),几乎与共价键相当。

这种亲和作用也不易受到pH 值、温度、有机溶剂的影响。

因而该方法被广泛应用于DNA生物传感器领域。

共价键固定法:通过共价键的方式将DNA 固定到电极表面具有众多的优点,如控制DNA 分子在电极表面的结合位置、空间、密度和方向,提高杂交效率。

共价键固定法的具体实现方式有很多,一般思路都是先在电极表面修饰羧基、羟基、氨基、磷酸基等功能基团,然后通过一些功能试剂进行一步或多步共价键结合。

对于碳电极,在酸性溶液中进行电化学氧化,容易在表面形成羧基,羧基可进一步被还原成羟基。

带有羧基的电极可以EDC(1-3(-dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimide) 和NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)将端位接有多个脱氧鸟嘌呤DNA((dG)n-DNA)分子共价键结合到表面。

对于金电极,通过巯基与金之间的共价结合是最常用的方法[5]。

3.电化学信号的检测DNA电化学生物传感器通过检测电化学信号来指示杂交愦况进而实现对特定序列目标DNA的分析检测,根据是否需要电化学指示剂可将检测方法分为直接检测和间接检测两大类。

直接检测法直接检测法[6]-[7]是指直接检测由杂交行为所引起的自身电信号的改变。

这主要是由于DNA碱基具存一定的电化学活性所导致的。

其中,最常用的是DNA碱基中的鸟喂吟(G),它较容易发生氧化反应。

Wang等用次黄嘌呤核苷的残基取代DNA探针的G碱雄(取代后仍能和C配对),从而可以通过检测染交过积后G碱基的氧化信号来检测目标DNA的含量[8]。

直接检测法的缺点在于氧化所需电位过正容易产生较大的背景电流，对信号干扰严重，灵敏度较低因此其应用受到一定的限制。

间接检测法由于DNA杂交产生的向身电信号的变化比较微弱,因而通常需要加入一些电活性指示剂来提高电化学传感器的灵敏度。

极据指示剂是否需耍标记,将其近一步分为非标记型指示剂和标记型指示剂。

非标记型杂交指示剂:非标记型杂交指示剂是一类能与ssDNA和dsDNA相互作用的电化学活性化合物,因此可以通过测记指剂的氧化还原信号达到间接测定目标DNA的目的。

一般来说,指示剂与DNA分子作用模式分为静电结合，面式结合和插入结合三种。

静电结合是指示剂分子、DNA分子带负电荷的磷酸骨架通过静电作用相互结合；面式结六足指示剂分子在沟面与DNA碱基通过疏水作用相互结合，插入结合是指示剂分子通过氧键、范德华力和堆积作用插入DNA 分子的碱基对之间。

标记型杂交指示剂[9]:标记型杂交指示剂一般标记在DNA信号探针的末端，在对目标DNA进行检测时,通过检测DNA信号探针标记的电活性物质在杂交后的电信号来间接检测目标DNA的含量。

常用的标记型杂交指示剂有二茂铁(FC)、亚甲基蓝(MB)等。

Takagi等在5'端胺基化的DNA信号探针上标记二茂铁。

与互补序列的目标DNA杂交后，用高效液相色谱分离,最后检测二茂铁的电化学信号,对目标DNA的检测范围为20-100 finol。

Plaxco等首次将分子信标引入电化学传感器,将一端修饰疏基另一端连有二茂铁信标分子的捕获探针自组装到金电极表面,设计了一种灵敏度高、特异性好的电化学生物传感器。

在未发生杂交反应时,探针保持莲环构型,末端连接的二茂铁分子靠近电极;而当溶液中含有互补序列的目标DNA时,莲环结构被打开,形成具有刚性结构的dsDNA,二茂铁分子远离电极。

通过检测二茂铁分子的氧化还原电流变化来指示杂交反应的发生。

同样基丁杂交前后探针构型的变化,Plaxco等不久又设计了一种“signal-on”的电化学检测方法[28],将一端修饰亚甲基蓝的信号探针首先与部分互补的捕获探针杂交。

此时亚甲基蓝远离电极,当与捕获探针能更好杂交的目标序列存在时,信号探针被目标DNA部分“竞争取代”,亚甲基蓝靠近电极表面产生更强的电信号响应,这种方法的检出限可以达到400 fmol[10]-[13]。

对于低浓度的目标DNA实现超灵敏检测在临床医学检验、遗传工程等领域的需求日盛,但对极低含量的目标DNA进行检测时,由于发生杂交反应的目标量很少,结上的电活性物质的量也很少，难以产生较强的杂交信号,因此如何进一步发展信号放大策略成为DNA电化学生物传感器的重耍研究方向[14]。

为提高检测灵敏度,研究者们发展了利用酶标记及纳米粒子标记等方法对检测信号进行放大。

随着越来越多新材料的发现，未来的传感器将朝着多通量、高精度、高灵敏度及无标记化方向发展。

此外，由于不同碱基具有细微差异的电化学特性，结合石墨烯和纳米材料的应用可以实现同一时间同一序列上不同的单个突变碱基的检测。

随着传感器的发展，在食品卫生、环境监测和指导临床用药及疾病诊断方面，传感器的应用将会迎来更美好的春天。

（自己研究的课题）参考文献[1] 赵燕珍,张海燕,吴小丽,刘仲明.DNA电化学生物传感器的研究进展[J].生物医学工程学杂志,2013,(1):208-212.[2] Luo,X. L.; Morrin, A.; Killard, A. J.; Smyth, M. R. Electroanalysis 2006, 18,319-326.[3]Wang, J. Anal. Chim. Acta2002, 469,63.朱珠.基于核酸酶信号放大的DNA电化学传感新方法研究[D].南京:南京大学理学院,2013.[4] Kagan, K.; Masaaki, K.; Eiichi, T. Meas. Sci. Technol. 2004,15,Rl.[5]Takenaka, S.; Uto, Y.; Kondo,H.; Ihara,T.; Takagi, M. Anal. Biochem. 1994,218,436.[6]Drummond, T. G.; Hill, M. G.; Barton,J. K. Nat. Biotechriol. 2003, 21,1192.[7]Fan, C.; Plaxco, K. W.; Heeger,A. J. Proc. Natl. Acad. Sci. II. S. A. 2003,100,9134.[8]樊浩.DNA电化学生物传感器中的新方法学研究[D].上海:华东理工大学化学系,2010.[9]左少华.电化学生物传感器的制备和应用研究[D].上海:华东理工大学,2013.[10]朱珠.基于核酸酶信号放大的DNA电化学传感新方法研究[D].南京:南京大学理学院,2013.[11] Xiao,Y.; Lubin, A. A.; Baker, B. R.; Plaxco, K. W.; Heeger, A. J. Proc. Nutl. Acad.Sci. U. S. A. 2006,103. 16677.[12]Pedano M. L., Rivas G. A. Adsorption and electrooxidation of nucleic acids at carbon nanotubes paste electrodes. Electrochemistry Communications. 2004, 6(1): 10-16.[13] R ehman, F, N.; Audeh, M.; Abrams, E. S.; Hammond, P. W.; Kenney, M.; Boles,T.C. Nucleic Acids Res. 1999,27,649.[14] Teh, H. F.; Gong, H.; Dong, X. D.; Zeng, X.; Lai, K.; Tan, A.; Yang, X.; Tan, S. N.Anal. Chim. Acta.2005,551, 23.。