＊　安徽省教育委员会资助课题作者单位:233003　蚌埠医学院卫生学教研室小鼠精子畸形试验方法的改进＊周纯先　肖　棣　王帮霞　王允滋摘要　目的:改进检测小鼠精子畸形的试验方法。

方法:采用改进的小鼠精子畸形试验方法进行观察,并与有关试验方法作对比研究。

结果:两种不同量0.9%生理盐水制备的小鼠精子玻片镜检显示,环磷酰胺阳性组和生理盐水对照组,其观察结果均以用1ml 0.9%生理盐水作稀释液制备的玻片镜检满意,符合小鼠精子畸形分析的试验要求。

结论:本法具有操作简便、镜检满意和结果可靠等优点。

关键词　精子计数　小鼠中国图书资料分类法分类号　R 321.1Improvement in method of sperm aberration test in miceZhou Chunxian ,Xiao Di ,Wang Bangxia ,Wang Yunzi(Department of Hygiology ,Bengbu Medical College ,Anhui 233003)A bstract Objective :To improve the method of sperm aberration test in mice .Methods :The im proved method for sperm aberration test was used in mice to compare w ith o ther methods .Results :Tests taken from cyclophosphamide mice and norm al saline treated mice w ere used to make sperm suspension in 2different volume (1and 3ml )of 0.9%saline for smear examination of abno rmal sperm under microscope .The result show ed that sperm suspended in 1m l saline w as satisfactory .Conclusions :This method has m any adventages ;it is easy to perfo rm ,the amount of sperm obtained is satisfactory fo r ex amination and the results are reliable .Key words sperm count ;mice 精子畸形试验常用于观察精子头部和尾部的形态异常,是研究外来化学毒物诱发人或动物精细胞突变和判断有无生殖毒性作用的常用方法之一。

目前用于检测小鼠精子畸形的试验方法有多种〔1,2〕,但其操作过程过于复杂,有的试验结果甚至不够理想。

本文目的是对有关试验方法进行改进,简化操作步骤,建立本实验室条件下的小鼠精子畸形试验方法,现作报道。

1　材料与方法1.1　动物　选用本院实验动物科提供的昆明种雄性小鼠,体重25～28g 。

1.2　试剂　环磷酰胺(上海产);0.9%生理盐水;1%伊红溶液。

1.3　实验方法　试验分2组,每组4只。

Ⅰ组为环磷酰胺阳性组,按40mg /kg 体重腹腔注射;Ⅱ组为0.9%生理盐水阴性对照组,按0.1ml /10g 体重腹腔注射。

各试剂物均每恩医科大学学报,1989,15(5)∶4423　李柏青,杨贵贞.小鼠胸腺上皮细胞增养上清的生物学活性.中华微生物学和免疫学杂志,1989,9(4)∶2224Geenen V ,Legros JJ ,Franchimont P ,et al .Coexsis tenc e of oxytoc in and neurophysin in the human thymus .Science ,1986,232(4749)∶5085Geenen V ,Defresne M P ,Robert F ,et al .The neurohormonal thymic microenvironment :Immunocytochemical evidence that thymic nurse cell s are neuroendocrine cells .Neuroendocrinology ,1988,47(4)∶3656　Amsen D ,K ruisbeek AM .T hymocyte selection :Not by TC R alone .Immunol Rev ,1998,165∶2097M arkwick AJ ,Lolait SJ ,Funder JW .Immunoreactive argininevasopressin in the rat thymus .Endocrinology ,1986,119(4)∶16908　Geenen V ,Kecha O ,Brilot F ,et al .The thymic repertoire ofneuroendocrine -related self antigens :Biol ogical rol e in T -cell selection and pharmacological impl ications .Neu roimmunomodulation ,1999,6(1,2)∶1159　M artens H ,Kecha O ,Charlet -Renard C ,et al .Neurohypophysialpeptides stimulate the phosphorylation of pre -T cell focal adhesion kinases .Neuroendocrinology ,1998,67(4)∶28210Geenen V ,M artens H ,Vandersmissen E ,et al .Cellular and molecular aspects of thymic T -cell education in neuroendocrine self principl es .Implications for autoimmunity .Ann NY Acad S ci ,1998,840∶328〔收稿日期　1999-06-04〕223蚌埠医学院学报1999年7月第24卷第4期DOI :10.13898/j .cn ki .issn .1000-2200.1999.04.002天1次,共5d。

两组小鼠均于末次处理后1周全部处死作精子畸形分析。

1.4　精子悬液制备及制片　用颈椎脱臼法处死小鼠,摘取双侧附睾分别置于盛有1ml和3ml0.9%生理盐水的平皿中(每组小鼠各作两份),用小剪刀将附睾组织剪碎后用小滴管轻轻吹打3～4次,并将组织碎片尽量取出,按1ml精子悬液加入1%伊红溶液0.1ml混匀染色1min后,取1滴于清洁的玻片上,均匀推片,空气自然干燥后作镜检。

每鼠制片2张,观察1000个精子并计数精子畸形数。

2　结果 两种不同量0.9%生理盐水制备的小鼠精子玻片镜检显示,不论是环磷酰胺阳性组,还是生理盐水阴性对照组,观察结果均以用1m l0.9%生理盐水作稀释液制备的玻片镜检满意,符合精子畸形分析的试验要求(见图1～4)。

3　讨论 小鼠精子畸形试验的成功与否,除试验设计符合要求外,其关键是精子悬液的制备和制片,它可直接影响镜检时有无足够的精子计数及试验结果的取得。

有方法介绍〔1〕小鼠精子头部异常检测时,精子悬液用0.9%生理盐水溶液3ml作稀释液,并用80μm丝网过滤去除附睾组织碎片,制片时一张玻片要重复推片3次等操作过程。

笔者曾直接采用上法作小鼠精子畸形分析研究,但所制玻片镜检时精子数量较少,每鼠计数1000个精子耗时较长,有时甚至难以满足结果分析的要求。

分析其原因认为主要是稀释液用量过多所致。

经试验改进后,减少0.9%生理盐水为1m l,并简化其操作过程,使试验结果达到满意要求,镜下视野中精子数量充分,背景清晰,容易计数结果分析所需精子数〔3～5〕。

另外,笔者也曾采用另一精子畸形试验方法〔2〕进行操作,在其方法中,采用1ml磷酸盐缓冲液生理盐水作精子稀释液,直接制片后用无水乙醇固定5min,空气干燥后直接镜检,或无水乙醇固定后再用2%伊红溶液染色后镜检(在染色缸内进行)。

本文对此试验方法进行了改进,直接用0.9%生理盐水1ml作精子稀释液,1%伊红溶液直接加入精子悬液中染色、制玻片及镜检,省去了磷酸盐缓冲液生理盐水的配制、无水乙醇固定和伊红溶液用染色缸染色等操作程序,而且不影响试验结果的观察。

本文采用改进的小鼠精子畸形试验方法作了对比研究,结果显示本法具有简便、易行、省时、镜检效果满意及不影响试验结果分析研究等优点,值得推广使用。

(本文图1～4见封二)参考文献1　布鲁西克著.吕　群,强义国,江绍慧译.遗传毒理学原理.上海:复旦大学出版社,1987.244～2472　刘毓谷.卫生毒理学基础.第2版.北京:人民卫生出版社,1998.215～2173　周纯先,王帮霞,肖　棣.维生素A和亚硒酸钠对菜油烟冷凝物致小鼠毒性作用的影响.癌变·畸变·突变,1998,10(4)∶2304　周纯先,肖　棣,王帮霞,等.氯化汞对小鼠毒性作用的研究.蚌埠医学院学报,1999,24(1)∶15　周纯先,王帮霞,肖　棣.维生素E对色拉油烟冷凝物致小鼠毒性作用的影响.癌变·畸变·突变,1999,11(2)∶89〔收稿日期　1999-05-17〕224Acta Academiae Medicinae Bengbu,July1999,Vol.24,No.4小鼠精子畸形试验方法的改进(正文见223页)　图1和图2　阴性组小鼠正常精子,分别用0.9%生理盐水3ml 和1m l 稀释附睾精子后制片镜检,图1中精子数少,图2中精子数较多,易于计数,伊红染色×200;图3和图4　阳性组小鼠精子,分别用0.9%生理盐水3ml 和1m l 稀释附睾精子后制片镜检,图3示小头畸形精子,图4中有畸形精子(头部异常伴双尾)和正常精子,伊红染色×200佝偻病动物模型建立及骨损伤实验观察(正文见228页)　图1　正常对照组:骺板厚度均匀,骨化线和细胞柱排列整齐　×200　图2　模型组:骺板增厚,细胞排列不整齐,肥大的软骨细胞直径增加　×200　图3　模型组:肥大的软骨细胞向骨干侧生长浸入,呈灶性分布,骨化线不齐　×200　图4　模型组:骨化线不整齐,骨小梁细疏,毛细血管不规则并浸入骺板软骨阴股沟皮瓣的解剖学研究与临床应用(正文见225页)图1　阴部外动脉分支、分布、吻合情况示意图肾盂输尿管连接部狭窄引起巨大肾积水1例(正文见236)图1　巨大肾积水,重10.5kg ,边界清楚,与周围组织不粘连。