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蛋白质结构组计划
• 目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三 维结构。
• 但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。 • 而且在这些表达的蛋白中，只有 28% 的重
组蛋白能够被纯化出来。 • 最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成
功的建立。
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蛋白质层析分离纯化机制
• 电荷不同：离子交换层析 • 大小、形状：凝胶过滤层析 • 疏水区域：疏水层析 • 特异性：亲和层析 （选择性是最优秀
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平台的操作（软件：知识结构）
• 实验室规模的层析应采用不大于50 µm的离 子交换或疏水介质，应具有10 cm左右，则 不少于 600个理论塔板。
• 精制：高效预装柱1 - 5 ml，10 µm左右粒 度，如Mono系列等。
• 通常条件下，采用15 µm的 Resource精制 也可以达到较好效果。
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平台的操作（软件：知识结构）
• 经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可 近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开； 6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的 蛋白。
• 通常，要达到3000个理论塔板的分子排阻 层析柱，如用50μm的介质，流速<20cm/h （参照产品说明书）应在80cm以上至 120cm，上样<5%，一般1-2%。
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整体柱（monolithic column ）
• 大孔结构 平均孔径为2μm的大孔网络，允许流动相 快速通过，反压极低，从而大大降低了分 离时间。
• 中孔结构 大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标 分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所 需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在 高流速时保持高柱效。
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样品通常特点及对后续纯化的影响
• 大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量 核酸；
• 运行层析，则蛋白浓度不应大于10 mg/ml。 • (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml.
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平台的操作（软件：知识结构）
• 样品处理及准备工作 • 用SDS-PAGE监测整个流程 • 富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽
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聚合物机体孔的结构
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结构：典型层析介质的放大观察
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孔的结构可分为三种类型
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整体柱（monolithic column ）
• 概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混 合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有 制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、 具有较高的柱效和可进行快速分离等优点, 已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用 色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了 应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、 芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物 质。
的）
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层析介质
• 生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生
物大分子失活，没有生物化学毒性—过强 吸附、泄露。
• 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条
件下是稳定的。
• 必要的机械性能：流体中的耐压性、弹
性。
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化学组成：亲水多孔高聚物等
亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析
溶液中加一定浓度的盐。
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平台的操作（软件：知识结构）
• E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有 特殊原因不要使用超声破碎法。
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整体柱（monolithic column ）
• 高流速 整体化色谱柱的总孔率约80％，填料具有优越的 渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也 很低 ；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。
• 高柱效 整体化色谱柱的柱效和3.5μm粒径的颗粒型色谱 柱相当，而大大优于5μm粒径的色谱柱。并且， 整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。
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整体柱（monolithic column ）
• 目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅 胶整体柱有SilicaRODTM和 PrepRODsTM。
• 默克 整体柱 ChromolithTM
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13蛋白质纯化平台. Nhomakorabea14
纯化平台的硬件结构
• 中心设备：中压至高压层析仪 • 辅助设备：过滤装置，超滤装置，离
• 目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛， 最好此前将溶液脱盐，并在含０ .２-０.４ M NaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。
• 如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris 等含氮的缓 冲成分，减少 π-π互相作用造成的吸附.
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梯度洗脱还是分步洗脱
• 蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000 倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗 脱——阶段洗脱或连续梯度洗脱
蛋白质层析技术
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导言
• 生物技术有三大部分：生化分离技术； DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。 其中生化分离技术是生物技术的基础和支 柱。
• 层析是最有效的分离手段，也是最重要的 蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法， 是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。
• 基因工程下游的核心是层析。
• 层析技术的理论和实践已高度发展和完善。
心机，蛋白质电泳等
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蛋白质纯化平台的结构和组成
• 含量较高的蛋白质纯化，基本可以在 三个层析步骤中实现。
• 用目标蛋白的三个独立的物理化学性 质进行层析分离。
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几步完成纯化？
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综合考虑样品的各种性质
稳定性（PH值，活性） 疏水性 分子大小，形状。 关键辅助因子
• 关键杂质 • 产品浓度 • 引进污染物 • 产品纯度 • 单位成本 • 产量
量低强度的抽提方法。 • 通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.
低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提 （如1：4左右）；
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平台的操作（软件：知识结构）
• 无特殊理由，pH应准确控制在中性附近， 尽量用酸性buffer；
• 缓冲容量：在pKa附近 缓冲容量正比于缓 冲溶液的总浓度；
• 最好运用(NH4)2SO4沉淀，缩小体积，便 于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。 个别情形中会造成不可逆沉淀；
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设计合理的方案
• 各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）
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• 分辨率：疏水层析<离子交换层析 • 载量： 疏水层析<离子交换层析 • 选择性：疏水层析>离子交换层析
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同样的起始样品不同的纯化方案
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通常纯化流程：选择性> 分辨率 >载量
• 目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交 换，选择性好，除核酸多糖；